基因工程的酶学基础.ppt

具EcoR1位点的DNA分子对DNA分子3‘端有控制的降解合成作用产生选择性标记T4DNA聚合酶的取代合成法标记DNA断末端及制备链的特异探针第95页,共122页，2024年2月25日，星期天４、反转录酶（reversetranscriptase）这类酶来自于反转录病毒，它可以RNA为模板，催化合成DNA。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反转录酶两种。具有反转录酶活性和RNaseH活性。主要作用是以mRNA为模板合成cDNA；用来对5’突出末端的DNA片断作末端标记。第96页,共122页，2024年2月25日，星期天第97页,共122页，2024年2月25日，星期天第98页,共122页，2024年2月25日，星期天合成cDNA的主要步骤：（1）、应用poly(A)mRNA为模板，以12～18个碱基长的oligo(dT)片断作为引物，加入反转录酶，合成出cDNA第一链;（2）、用碱水解法除去mRNA模板，单链cDNA能自我折叠形成一种发夹结构，作第二链的引物，用反转录酶或Klenow聚合酶催化第二链cDNA的合成；（3）、用SＩ核酸内切酶消化除去单链区的发夹结构。（4）、通过同聚物或合成的衔接物，使DNA分子克隆到适当的载体分子上。第99页,共122页，2024年2月25日，星期天第100页,共122页，2024年2月25日，星期天5.T7DNA聚合酶：1978年，S.Tabor从感染了T7噬菌体的大肠杆菌寄主细胞中纯化出来的一种核酸酶。具有5’3’的聚合酶活性和很高的单链及双链的3’5’核酸外切酶活性。第101页,共122页，2024年2月25日，星期天T7DNA聚合酶的用途：（1）、用于对大分子量模板的延伸合成；（不受DNA二级结构的影响，聚合能力较强可延伸合成数千个核苷酸）（2）、通过延伸或取代合成法标记DNA3’末端（3）、将双链DNA的5’或3’突出末端转变成平末端的结构。第102页,共122页，2024年2月25日，星期天6.修饰的T7DNA聚合酶对天然的T7DNA聚合酶进行修饰，使之完全失去3’5’的外切酶活性。聚合作用的速率增加了3倍。第103页,共122页，2024年2月25日，星期天用途：（1）、作为一种DNA序列分析的工具酶：加工性能高；无3’5’的外切酶活性；具有催化脱氧核糖类似物聚合的能力。（2）、制备探针；可催化较低水平的dNTP（0.1μmol/L）参入。（3）、有效的填补和标记具有5’突出末端的DNA片断的3’-末端。聚合作用高；失去了3’5’的外切酶活性第104页,共122页，2024年2月25日，星期天4．其他酶第105页,共122页，2024年2月25日，星期天1、末端核苷酸转移酶（terminaltransferase）该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase），它是从小牛胸腺中纯化出来的一种小分子量的碱性蛋白质，在二甲胂酸缓冲液中，能催化5’脱氧核苷三磷酸进行5’－3’方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3’-OH末端。第106页,共122页，2024年2月25日，星期天它不需要模板，可以用含有的3’-OHDNA片段为引物，在3’-OH端加入核苷酸达几百个它作用的底物可以是具有3’-OH末端的单链DNA,也可以是具有3’-OH突出末端的双链DNA第107页,共122页，2024年2月25日，星期天第108页,共122页，2024年2月25日，星期天第109页,共122页，2024年2月25日，星期天用途：1.催化[α-32P]-3’-脱氧核苷酸标记DNA片断的3’末端。可用于测序的终止，一般不含游离的3’-OH末端2.催化非放射性的标记物掺入到DNA片断的3’-末端：生物素等，掺入后可产生荧光染料或抗生物素蛋白结合物的接受位点3.用于在平头DNA上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端第110页,共122页，2024年2月25日，星期天（２）碱性磷酸酶：来自于大肠杆菌（bacterialalkalinephosphataseBAP）或小牛肠（calfintestinalalkalinep