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Map2k6基因座内三个片段的敲除小鼠的制备的开题报告

开题报告：

一、研究背景与意义

MAP2K6是一个丝裂原活化蛋白激酶(MEK)家族中的成员，它可以通过激活ERK1/2信号通路参与细胞凋亡、细胞分化、生长发育等多种生物学过程。近年来的研究表明，MAP2K6在肿瘤、炎症、心血管等疾病的发生发展中扮演着重要的角色，其过度表达或突变均与这些疾病的发生有关。因此，深入探究MAP2K6的生物学功能以及其在疾病中的作用机制具有重要的意义。

现有的研究中，利用CRISPR/Cas9技术敲除MAP2K6基因表达可以用于深入了解其生物学功能和作用机制。然而，MAP2K6基因较长，sgRNA的设计和筛选较为困难。因此，本研究计划针对MAP2K6基因座内的三段片段进行敲除，以对MAP2K6的功能进行全面研究。

二、研究内容与方法

本研究将利用CRISPR/Cas9技术敲除MAP2K6基因座内的三个片段，分别为片段A、片段B和片段C。设计sgRNAs以靶向目标序列，合成对应的肝型CRISPR/Cas9递送载体，将其转染至小鼠胚胎干细胞中，筛选出正常生长的敲除小鼠作为研究对象。

具体实验步骤如下：

1.设计合成sgRNAs。根据MAP2K6基因座内片段A、B、C的序列，使用CRISPR在线设计工具筛选目标序列，并合成sgRNAs。

2.构建肝型CRISPR/Cas9递送载体。将合成的sgRNAs与Cas9基因克隆至肝型载体中。

3.转染小鼠胚胎干细胞并筛选。将携带肝型CRISPR/Cas9载体的小鼠胚胎干细胞培养至合适密度后转染，收集细胞，进行筛选。

4.分离培育敲除小鼠。收集筛选出的正常生长的敲除小鼠，组建饲养小鼠群体。

5.对敲除小鼠进行基因分析和功能研究。利用PCR、Westernblotting等技术对敲除小鼠进行基因分析和功能研究。

三、研究预期结果

本研究计划通过敲除MAP2K6基因座内的三个片段，筛选出正常生长的敲除小鼠，进行基因分析和功能研究，深入探究MAP2K6在细胞凋亡、细胞分化、生长发育等方面的生物学功能及其在肿瘤、炎症、心血管等疾病发生发展中的作用机制，为相关疾病的治疗提供新的理论支持和实验基础。