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双荧光素酶报告基因检测原理

荧光素酶（英文名称：Luciferase）是自然界中能够产生生物荧

光的酶的统称，其中最有代表性的是一种学名为Photinuspyralis的

萤火虫体内的荧光素酶。在相应化学反应中，荧光的产生是来自于萤

光素的氧化，有些情况下反应体系中也包括三磷酸腺苷（ATP）。没

有荧光素酶的情况下，萤光素与氧气反应的速率非常慢，而钙离子的

存在常常可以进一步加速反应（与肌肉收缩的情况相似）。

双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测,通常一个报

告基因作为内对照,使另一个报告基因的检测均一化。检测基因表达时

双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共

转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。通常实验报告基因

偶联到调控的启动子,研究调控基因的结构和生理基础。报告基因表达

活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成

型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照,使测试不被实验

条件变化所干扰。

通过这种方法,可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性,比如,

培养细胞的数目和活力的差别,细胞转染和裂解的效率。

理想的双报告基因方法应该使用户能够以萤火虫荧光素酶所具有

的速度,灵敏和线性范围对同一样品中的两个报告基因同时测定。这在

传统的报告基因,如CAT,β-Gal和GUS是不可能的,由于它们测试化

学,处理要求所固有的局限。相反,结合萤火虫(Photinuspyralis)和

海洋腔肠(Renillareniformis)双荧光素酶的系统可满足这些要求，

在单管中完成这些测试。

双荧光素酶报告基因检测原理：

将目的基因3’UTR区域或者lncRNA序列构建至载体中报告基

因Luciferase的后面，构建荧光素酶质粒。然后转染至细胞中，通过

比较过表达或者干扰miRNA后，检测报告基因表达的改变（以萤火虫

荧光素酶为报告基因，以海肾荧光素酶为内参基因）可以定量反映

miRNA对目的基因的抑制作用。结合定点突变等方法进一步确定

miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。

常用荧光素酶报告基因载体：

1、pRL-TK这个载体是由Promega开发的，pRL-TK是海肾荧光

素酶报告载体，含有SV40增强子，质粒图谱如下所示：

2、pGL3-Basic是萤火虫荧光报告载体，图谱如下图所示：

从这两个图谱中可以发现，ppGL3-Basic这个载体主要是用于评

估miRNA与靶基因3’UTR的结合，靶基因的3’UTR放在荧光素酶

的后面，这个荧光素酶是荧火虫荧光素酶，而pRL-TK这个载体则表达

海肾荧光素酶，将这两个质粒共同转染进入293细胞中来检测荧光时，

pRL-TK这个质粒起到一个内参的作用。

3、pmir-GLO将荧火虫荧光素酶与海肾荧光素酶构建到一个载体

上，偏差更小且单质粒转染比双质粒共转染更简单。该质粒也是由

promega公司开发的，图谱如下所示：

实验基本流程：

1、重组质粒制备:制备含有待检测基因Luc/Rluc的重组质粒；

2、共转染:将带有Luc/Rluc标记的报告基因和目的基因进行共转

染，通常24-48h；（选择转染效率较高的HEK-293T细胞或原代细胞

等）

3、细胞处理:双荧光素酶检测试剂盒依照protocol操作；

4、荧光检测:使用酶标仪或具有类似检测功能的设备进行荧光强

度检测

5、数据分析

实验案例：

CDK9是miR-206的靶标(a)，但是CDK9突变型不是miR-20