微量分光光度计校准规范.docx

JJF1836—2020

1

微量分光光度计校准规范

1范围

本规范适用于微量分光光度计的校准,对于其他类型的分光光度计仪,可参照本规范执行。

2引用文件

本规范引用了下列文件:

JJG178—2007紫外、可见、近红外分光光度计检定规程GB/T26810—2011可见分光光度计

凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本规范;凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本规范。

3概述

微量分光光度计体积小,样品用量少[(1~2)μL],由光源、单色器、吸收池、检测器以及信号指示系统五个部分组成。原理是基于物质对不同波长光的选择性吸收和朗伯-比尔(Lambert-Beer)定律对物质进行定量分析和定性鉴别,常用于核酸与蛋白质的定性、定量分析以及菌液浓度的定量。

朗伯-比尔定律的数学表达式为:

A=-lg(I/I0)=-lgT=klc

式中:

A———物质的吸光度;

I0———入射的单色光强度;I———透射的单色光强度;

T———物质的透射比;

k———物质的吸光系数;

l———被分析物质的光程;c———物质的浓度。

检测时,用移液器将(1~2)μL样品滴加到检测平台上,仪器自动完成测试,显示吸光度值,给出样品(核酸、蛋白质和荧光染料)定性和定量结果。

4计量特性

4.1示值误差4.2重复性

4.3线性和线性范围

JJF1836—2020

2

5校准条件

5.1环境条件

仪器使用允许的环境条件,温度:(15~35)℃、相对湿度:(10~80)%,校准过程中测量并记录环境的温度、相对湿度。

5.2校准用标准物质及试剂5.2.1校准用标准物质

校准时应采用有证标准物质,包括:DNA标准物质,其特性量值(10~2000)ng/μL,相对扩展不确定度≤10%(k=2);RNA标准物质(10~2000)ng/μL,相对扩展不确定度≤10%(k=2)或蛋白质标准物质(50~2000)ng/μL,相对扩展不确定度≤10%(k=2)。

5.2.2试剂

电阻率达到18MΩ·cm(25℃)的蒸馏水或三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(TE)缓冲溶液等,用于仪器空白校准用。

5.2.3移液器

规格:最大量程2μL、2.5μL、10μL,需检定合格。

6校准项目和校准方法

6.1示值误差

选择DNA,RNA或蛋白质含量标准物质,用仪器自动设定的光程在仪器上分别测定260nm、280nm处吸光度值及对应的含量值,记录260nm(DNA或RNA)处或280nm(蛋白质)处3次含量值的算术平均数与标准值之差,按式(1)计算其示值误差。

(1)

式中:

δX———示值误差,ng/μL;X0———标准值,ng/μL;

Xi———测定值,ng/μL;

n———测定次数。6.2重复性

选择DNA,RNA或蛋白质含量标准物质,用仪器自动设定的光程在仪器上分别测定260nm、280nm处吸光度值及对应的含量值,记录260nm(DNA或RNA)处或280nm(蛋白质)处重复测定6次含量值,按式(2)计算含量值标准偏差。

(2)

JJF1836—2020

3

式中:

s———标准偏差;

X———6次含量测定值的算术平均值;Xi———单次测定值;

n———测定的次数;

i———测定的序号,i=1~6。6.3线性和线性范围

选择不同含量的DNA标准物质,浓度范围在(10~2000)ng/μL及合适浓度的RNA或蛋白质标准物质,至少5个浓度梯度,用仪器自动设定的光程在仪器上测定(260nm处和280nm处)空白和各标准物质的吸光度对应的含量值