(2.6)--[8]chapter8酶工程酶工程酶工程.pptVIP

*适应面广第一节酶定向进化的特点酶定向进化是非理性化设计，不需要了解酶的信息，随机产生突变体*50℃培养突变文库定向选择选择压力：温度温度耐受型突变体最适生长温度为37℃第一节定向进化的特点目的性强诱发突变定向进化可以针对特定基因定向进行筛选，可针对特定功能进行，如热稳定性。*第一节酶定向进化的特点效果显著短时间完成酶在自然界中几千年进化历程，且进化方向符合人类社会需求；*效果显著第一节酶定向进化的特点*概念对比：定向进化定点突变定点突变（site-directedmutagenesis）：在DNA序列中某一特定位点上进行碱基改变从而获得突变基因的操作技术。酶分子的定向进化：模拟自然进化的过程，在体外对酶基因进行人工随机突变，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有预先期望的具有某些特性的酶的技术过程。*定点突变的步骤首先分析酶分子的空间构象，明确结构与功能的关系后，改变蛋白质中的个别氨基酸残基，得到新的酶分子。1、新的酶分子结构设计2、突变基因碱基序列的确定3、突变基因的获得4、新酶的获得*定点突变的特点定点突变只能对天然酶蛋白中少数的氨基酸残基进行改变；仅适用于三维结构清楚、结构和功能的相互关系也较清楚的酶，属于理性设计(rationaldesign)。不改变酶蛋白的高级结构，对酶功能的改造较有限；*定向进化的特点1、非理性设计，适应面广2、目的性强突变可针对特定基因定向进行筛选针对特定功能进行3、效果显著短时间完成酶在自然界中几千年进化历程，且进化方向符合人类社会需求；*随机突变第二节酶基因的随机突变定向进化的第一步，对酶基因进行随机突变，以获得丰富多样的突变基因。*第二节酶基因的随机突变特点1、易错PCR技术error-pronePCR从酶的单一基因出发，在特定的反应条件下进行PCR扩增，使碱基配对出现错误而引起基因突变2、DNA重排技术DNAshuffling从两条以上的正突变基因出发，经过酶切和不加引物的PCR扩增，使碱基序列重新排布而引起基因突变3、基因家族重排技术DNAfamilyshuffling从基因家族的若干基因出发，经过酶切和不加引物的PCR扩增，使碱基序列重新排布而引起基因突变*PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。课外拓展：科学怪才——PCR的发明者*TaqP1P2PCR反应体系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：DNA引物：P1P2DNA聚合酶：Taq原料：dNTP反应缓冲液辅助因子：Mg2+错配率：10-6*易错PCR是在采用Taq酶进行PCR扩增目的基因时，通过调整反应条件，例如提高镁离子浓度，加入锰离子，改变体系中四种dNTP的浓度等，使用低保真度的Taq酶，从而向目的基因中，以一定的频率随机引入突变构建突变库，然后选择或筛选需要的突变体。2.1易错PCR技术(error-pronePCR)TaqP1P2dATPdTTPdGTPdCTPMg2+错配率：0.6%-2%*举例：L—天冬氨酸酶定向进化研究进行4轮易错PCR，筛选了3000个突变菌落，得到酶活力提高28倍的突变体。2.1易错PCR技术(error-pronePCR)*优点：操作方便随机突变丰富2.1易错PCR技术(error-pronePCR)*一个具有正向突变的基因在下一轮易错PCR过程中继续引入的突变是随机的，而这些后引入的突变仍然是正向突变的概率是很小的。正向突变；活力提高第二轮易错PCR负向突变：失活2.1易错PCR技术(error-pronePCR)缺点：累积正突变的概率低，突变基因文库较大，文库筛选量大，适用于小基因的定向进化。怎样“强强联合”更有效地累积正突变呢？*需要开发出一种新的基因重组策略，将已经获得的存在于不同基因中的正突变结合在一起形成新的突变基因库。2.2DNA重排技术(DNAshuffling)*2.2DNA重排技术(DNAShuffling)1.DNaseI产生随机片段；2.随机片段变性；3.随机片段复性；4.延伸反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段*DNA重排技术:从两条以上的正突变基因出发，经过酶切和不加引物的PCR扩增，使碱基序列重新排布而引起基因突变。2.2DNA重排技术(DNAShuffling)*DNA改组具有以下优点：可利用现存的