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酵母蔗糖酶蛋白质含量测定方法比较

摘要：蛋白质与生命起源、存在和进化都紧密相关，蛋白质测定涉及到生产和科研的众多领域。对某种蛋

白质而言，准确测定蛋白质的含量对于其性状分析与应用具有重要意义。在Folin-酚法测定蔗糖酶蛋白浓

度的基础之上，本实验继续使用紫外吸收法、考马斯亮蓝法和BCA法进行蔗糖酶浓度的测定，分析总结各

方法的特点。

关键词：酵母蔗糖酶，蛋白质浓度测定，紫外吸收法，考马斯亮蓝法，BCA法

前言

对某种蛋白质而言，准确测定蛋白质的含量对于其性状分析与应用具有重要意义。目

前有多种测定蛋白质含量的方法,主要分为直接测定和间接测定；直接测定的依据为蛋白

质的物理特性，主要代表为紫外吸收法；间接测定主要依据为螯合性、吸附性等实验材料

的化学性质，常见的有凯氏定氮法、等电点沉淀法、BCA法等。本实验以酵母蔗糖酶为实

验材料，对紫外吸收法、考马斯亮蓝法和BCA法三种常见的测定方法进行实验与评估，通

过不同的待测样品、具体实验过程和结果的分析来确定这几种方法对于酵母蔗糖酶测定的

适用性及可行性。

1分析检测方法

1.1紫外吸收法

紫外吸收法实验原理为：蛋白质中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环的共轭双键使

蛋白质能够吸收紫外光，其吸收高峰在280nm处，吸光度与蛋白质含量成正比；同时，蛋

白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。故可利用一定波长下蛋白质溶液的光吸

收值与其浓度的正比关系对蛋白质含量进行测定。

紫外吸收法测定蛋白质的浓度范围为0.1～1.0mg/ml，该方法适于用测定与标准蛋白

质氨基酸组成相似的蛋白质，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有

一定的误差；若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会产生较大的干扰。需

要注意的是进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要

确保测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。

1.2考马斯亮蓝法/Bradford法

考马斯亮蓝法实验原理为：考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合显色，该反应十分迅速且

稳定，2min左右即达到平衡。其结合物室温下1h内保持稳定，在5~20min间颜色的稳

定性最好。考马斯亮蓝法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法，适用于测定对灵敏度要求较高、

需要快速定量的微量蛋白质。

考马斯亮蓝法优点为操作简便，所用试剂较少，显色剂易于配制，干扰物质少，如糖、

缓冲液、还原剂和络合剂等均不影响显色；缺点是由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基

酸的含量不同，在用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，标准曲线也有轻微的非线性。故在

制作标准曲线时通常选用y-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差；且只能用标准曲

线来测定未知蛋白质的浓度。

1.3BCA法

2++

BCA法反应原理为：蛋白质中的肽键将Cu还原成Cu，后者在碱性条件下与BCA络合

生成紫红色络合物。此化合物在540~590nm内有最大吸收波长，反应物的颜色和蛋白浓度

2++

在一定范围内具有线性关系。在60℃，肽键将Cu还原为Cu的作用比在室温更大;另外，

2++

蛋白中的色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、胱氨酸等还原性氨基酸能够将Cu还原为Cu，但该

反应与温度关系较弱。

BCA法可分为常量法和微量法：常量法中反应液和样品的总体积在1~4ml；微量法中

在20~200μL。微量法测定快速，节省试剂和药品，适于测定较多样品，采用微量法时，对

0.5~10μg/ml的蛋白质样品可准确测定。BCA钠盐是稳定的水溶性化合物，正常的工作液

应当是果绿色。A液与B液分别在室温下保存1周，BCA法测定结果无显著差异。

BCA法具有结果准确、灵敏快速、经济适用等优点，受表面活性剂和有机溶剂的影响较

小，可用于反胶束萃取法萃取的蛋白分析；受尿素的影响较小，可用于牛乳蛋白质的定量

分析。

2实验步骤

2.1紫外吸收法

2.1.1标准曲线绘制