腺病毒的几种冻干技术—李战.pptVIP

1.腺病毒（载体）应用在基因治疗和疫苗研究学领域，腺病毒作为基因转移的载体，被广泛地使用。其中，重组腺病毒载体能够诱导较强的细胞和体液免疫反应。较易生产，成本较低，对人致病性小且不诱导癌变，繁殖滴度高，装载容量大，成为近年来病毒载体研究热点。2.腺病毒（载体）在临床应用的局限性通常保存于含10%甘油的缓冲液中，并于-80℃储存。运输以及临床使用时须在干冰上进行。使用前需要大量稀释以减轻甘油的毒性和肌肉注射时的疼痛感。对温度也较为敏感，给运输、保存带来较大困难。迫切需要发展在冷藏条件下能使腺病毒稳定的新的复合物一、腺病毒（载体）概述是指把药品溶液在低温下预先冻结成固体，然后在低温、真空条件下使水蒸汽直接从固体中升华出来，除去自由水后再进行二次干燥，除去部分吸附于固体晶格间隙中的结合水的干燥方法。低温下进行，避免药物受热分解，特别适用热敏性的物质低压下干燥，基本隔绝了空气，药品不易氧化变质，缺氧环境能抑制某些细菌的活性药品可形成“骨架”，能较好地保存其原料的组织结构和外观形态复水性好，冻干药品可迅速吸水还原成冻干前的状态脱水彻底，适合长途运输和长期保存二、冷冻干燥技术机械效应：温应力、冻结应力、干燥应力溶质效应电解质浓度增加，pH值改变病毒结构改变或核酸受损机械性能稳定的冻干机合理的冻干曲线组方合理、效果优秀的稳定保护剂根据冻干后性状、效价及安全性检验等不断调整配方及冻干曲线，以达到理想的效果蔗糖明胶海藻糖无免疫原性，无毒性冷冻升华时不起泡，冻干后易溶解在冻干和保存过程中有保护作用有利于生物活性的保持与蛋白质不发生化学反应，不影响冻干制品的检测；首先应了解其结构与特点，测定其共晶点温度根据产品在预冻干过程中电阻变化率来确定采用热分析法通过绘制冷却曲线来确定根据共晶温度判断是否需要加入添加剂（包括赋形剂、稳定剂等）判定何种物质和加入量冻干后，进行外观、水分等项目观察与测定，逐渐修改处方和重复试验，至指标相似或相同为止三、冷冻干燥的程序外观活性测定水分测定样品测共晶点加赋形剂加稳定剂冻干样品处方修改重复试验冻干样品留样观察稳定性考察加速试验确定工艺图1.冻干工艺确定流程图2.1预冻产品必须全部冻结后才能在真空下进行升华，否则真空干燥时会造成收缩、变形以及冻干制品表面硬化现象。产品在升华开始时必须要冷到共晶点以下的温度，使冻干产品真正全部冻结。预冻成功的关键：共晶点测定准确合适的保护剂配方最佳预冻速度适宜的冻结时间2.2干燥阶段升华干燥：合理控制升华速度，一般为较缓慢的升温解析干燥：尽可能高的温度尽可能低的真空度时间应根据样品的热稳定性而定2.3封口保存真空压塞充气压塞2.4复水冻干药品可在室温下避光长期保存。需要使用时，加蒸馏水或生理盐水制成悬浮液使用。2.5冻干曲线在冻干过程中，把产品和板层的温度、冷凝器温度和真空度对照时间划成曲线，叫做冻干曲线温度为纵坐标，时间为横坐标不同的产品，不同的冻干机应用不同的冻干曲线必需通过反复试验来确定冻干曲线以保证产品质量和缩短生产周期一、冻干重组人三突变型低氧诱导因子－1α腺病毒的制备来源：南方医科大学2008级博士学位论文作者：陶宇四、国内外几种腺病毒（载体）的冻干方法前期工作：1.将低氧诱导因子－1（hypoxiainduciblefactor-1，HIF-1）联合突变，成功构建了重组人三突变型HIF-1α腺病毒（Ad-HIF-1α-564／402／803），获得在常氧条件下可稳定表达且生物活性高的HIF-1α。2.重组腺病毒的大量扩增、纯化腺病毒以MOI≥5感染已长至70％汇合度的HEK293A细胞，37℃5％CO2培养箱中培养，待大部分（＞90％）细胞出现病变效应——处理——收集病毒液。方法与步骤：1.试验分组A组，10％海藻糖、0．5％明胶、3％山梨醇B组，10％蔗糖、0．5％明胶、3％山梨醇C组，5％海藻糖、5％蔗糖、0．5％明胶、3％山梨醇对照组（不加保护剂）按照百分比要求，加入到磷酸盐缓冲液（KPBS）中，用孔径0．22μm滤膜过滤除菌。2.腺病毒分装将重组人三突变型HIF-1α腺病毒原液按1∶1比例分别加入到上述含有冷冻干燥保护剂的溶液中混合，0．5mL／西林瓶，待冻干。3.冻干曲线