显微镜的原理和使用.docx

光学显微镜的原理和应用

简 介

一、光学显微镜发展历史与最新进展

已近400年的历史。十九世纪之前发展非常缓慢。

1665年：英国物理学家R.Hoock的第一台显微镜的雏形。十八世纪初：慧更斯目镜的发明。

十九世纪中：Lister和Amici制造了消色差物镜，部分消除了色差，后者首次制成水浸物镜，使数值孔径NA?1。

1886年：ErnstAbbe与CarlZeiss第一个生产出了复消色差物镜,消除了球差和色差的干扰，提高了数值孔径(1.4)，并奠定了现代光学理论原理。

1893年： AugustK?ler教授发明了著名的柯勒照明。

1890-1899年：金相显微镜、消像散透镜和双筒目镜以及第一台体视显微镜的诞生。二十世纪初：出现了齐焦物镜。

1932年底： 诞生了透射电子显微镜，电子显微镜的分辨率是传统光学显微镜的1000倍以上。

1930－1940年：显微分光光度计的出现，预示着显微定量技术的开始。

1940－1950年：出现了荧光显微镜。

二次大战之前：Zeiss公司基于诺贝尔奖获得者荷兰物理学家 FritsZernike的光学理论制造了第一台观察活细胞的相差显微镜。

1955年： 物理学家GeorgesNomarski改良了Wollaston棱镜，诞生了另外一种增强

活细胞反差技术的显微镜－Nomarski干涉显微镜即微分干涉差显微镜。

1975年： RobertHoffman又提出了一种增强活细胞反差的技术，即Hoffman调制相差显微镜。

1970－80年：医学图像处理与分析系统

1970－80年：流式细胞仪

1980－90年：诞生了激光扫描共焦显微镜。比普通光学显微镜的分辨率提高了1.5倍。

80年代末和90年代初：诞生了双光子扫描显微镜。

二十世纪90年代末?至今：全内反射显微镜，物镜数值孔径达到了1.6。分辨率：

普通光学显微镜：xy-0.25?m

共焦显微镜：xy-0.18?m，z-300nm全内反射显微镜：z-100nm4pi：z?100nm

STED：xy-20nm

透射电镜：xy-0.1nm

二、生物光学显微镜主要种类：

眀场透射光显微镜:观察经过组化染色的标本。

暗视野显微镜：适于观察未染色的标本－活细胞。散射光成像。

相差显微镜： 适于观察活细胞。光相位差转换成振幅差。

微分干涉差显微镜:适于观察活细胞。利用双束偏振光的干涉增强反差。荧光显微镜： 观察标记了荧光探针的样品（活细胞或固定样品）。

偏振光显微镜：利用偏振光观察晶体结构或具有双折射性的结构，如:细胞骨架、纤维、膜。

Hoffman调制相差显微镜：观察活细胞

三、光学显微镜的基本组成

光学显微镜主要由光学成像部分和机械结构部分组成。光学成像：物镜、目镜、照明系统、滤片系统

机械结构：镜座、镜臂、载物台、镜筒、

物镜转换器、调焦装置

光学成像部分：

（一）物镜

组成和作用：由凹凸透镜组成，直接使样品成放大倒立的实像（放大1100倍）。物镜品质的好坏、档次的不同决定了整个显微镜的质量。

分类

按介质不同分类：

干燥物镜（简称：干镜）（空气n=1）油浸物镜（简称：油镜）（油n=1.515）水浸物镜（简称：水镜）（水n=1.333）

按校正像差分类：

消色差物镜（achromaticobjective）平场消色差物镜（planobjective）

平场半复消色差物镜（planfluotarobjective）

平场复消色差物镜（planapochromatic objective）3）按工作距离分类

长工作距离物镜普通工作距离物镜

按功能分类

相差物镜偏振光物镜

微分干涉差物镜

按镜筒长度分类有限远物镜无限远物镜

（二）目镜

组成和作用：由凹凸透镜组成，将物镜形成的倒立 实像放大为 10-16

倍的虚像。

按目镜视场数可分为：非广角目镜、广角目镜、超广角目镜等。

对于10X目镜而言,

视场数18mm，常称为非广角目镜。视场数≥18mm,常称为广角目镜。视场数20mm,常称为超广角目镜。

（三）照明系统

视场光阑

聚光器

光源

视场光阑

视场光阑常位于支架底座上，其光阑大小能连续改变，它通过聚光镜能清晰地成像在标本面上。所以在目镜中看清标本的同时也能看到视场光阑多边形或圆形图像。可变视场光阑的像应外切于目镜中的视场光阑，使光线只能照明需观察的标本，尽可能减少标本四周的散射光。

聚光镜（器）组成和作用：

由前端透镜、可变孔径光阑组成。作用是改变入射光的强度，调节光束大小，使光源发出的光线形成一束与物镜数值孔径大小相适应的光束