质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告.pdfVIP

......

质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶

电泳

一、前言

质粒

质粒是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够

自主复制的较小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。大部分

的质粒虽然都是环状构型，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物（多

为原核生物）中，乃至于植物的线粒体等胞器中。然而，1984年，

在Streptomycescoelicoler(天蓝色链霉菌)等放线菌以及在

Borreliahermsii(赫氏蜱疏螺旋体)等原核生物中，又相继发现线形质

粒。

天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。质粒

天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至

于数种的质粒同时存在。质粒的套数在细胞里从单一到数千都有可

能。有时有些质粒含有某种抗药基因(如大肠杆菌中就有含有抗四环

素基因的质粒)。有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理

代能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。一般来说，质粒的存

在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。它是基因工程最常见的运

载体。

质粒在细胞的复制一般有两种类型:紧密控制型和松弛控制型。

前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不

...专业..

......

能复制，通常每个细胞只含有一个或几个质粒分子，如F因子。后者

的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，

一般在20个以上，如ColE1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉

素时，细胞蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制，

紧密型质粒复制停止，而松弛型质粒继续复制，质粒拷贝数可由原来

20多个扩增至1000-3000个，此时质粒DNA占总DNA的含量可由

原来的2%增加至40-50%。

把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细

胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体。细菌质粒是重组DNA技术中

常用的载体。质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构。质粒还带有

某些遗传信息，所以会赋予宿主细胞一些遗传性状。其自我复制能力

及所携带的遗传信息在重组DNA操作，如扩增、筛选过程中都是极

为有用的。

质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工

构建的。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择

性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性

切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分

子量尽可能减少，以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用

途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、

产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片

段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应

有下列一些特性:⑴分子量小、多拷贝、松弛控制型;⑵具有多种常用

...专业..

......

的限制性切酶的单切点;⑶能插入较大的外源DNA片段;⑷具有两个

以上的遗传标记物，便于鉴定和筛选。⑸对宿主细胞无害。常用的质

粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM

系列和pBluescript(简称pBS