分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法.pptVIP

扉页：

当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放下你的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象，否那么，你对事物的观察就会受影响；当你翻开书本的时候，你又必须尽可能展开想象的“翅膀〞，否那么，你就不可能走在别人的前面。;二、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保存复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题。;GeneralizedmodelofsemiconservativereplicationofDNA.Newsynthesisisshowninblue.;三、50年代末至60年代，相继提出了“中心法那么〞和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，说明了遗传信息的流动与表达机制。;;中心法那么的演变;上个世纪中下叶以来，现代分子生物学的迅猛开展源自工具酶的发现。

5.1基因操作的根本工具

〔一〕限制性核酸内切酶

能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。

第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。;图5-1几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端。;WernerArber,HamiltonSmithandDanielNathanswereawardedthe1978NobelPrizefortheirworkonREs.;图5-2DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体;;RE切割随机DNA分子〔假定4种碱基在DNA中均匀分布〕的概率由该酶所识别的碱基数目按照4n来计算，如一个6碱基切割酶平均每4096bp核DNA有一个酶切位点〔46〕，而一个4碱基切割酶平均每256bp核DNA就有一个酶切位点〔44〕。;重组DNA实验中常见的主要工具酶;嘌呤;多聚核苷酸链中新生磷酸糖苷键的产生过程;〔二〕基因克隆的载体

载体三要素：

自我复制能力

携带外源基因片段大小

插入位点多少

易于鉴定识别程度;大肠杆菌质粒载体:

1、pSC101质粒载体

长9.09kb，带有四环素抗性基因〔tetr〕及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的单酶切位点，在HindIII、BamHI和SalI等3个位点插入外源基因，会导致tetr失活。;大肠杆菌pSC101质粒载体示意图。;是第一个基因克隆载体。缺点：它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，平均每个寄主细胞仅有1~2个拷贝，从带有该质粒的寄主细胞中提取pSC101DNA，产??很低。;2、ColE1质粒载体

松弛型复制控制的多拷贝质粒。

一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或是在细胞培养物中参加氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。

松弛型质粒DNA却继续复制数小时，使每个寄主细胞中ColE1质粒的拷贝数到达1000~3000个，占细胞总DNA的50%左右。;3、pBR322质粒载体

由三个不同来源的局部组成的：

第一局部来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因〔AmpR〕；

第二局部来源于pSC101质粒的四环素抗性基因〔tetr〕；

第三局部那么来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点〔ori〕。;优点是具有较小的分子量(4363bp)，易于纯化。即使携带了6-8kb的外源DNA片段，操作仍较便利。

有两种抗生素抗性基因作为转化子的选择标记。

有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增，每个细胞可累积1000~3000个拷贝，便于制备重组体DNA。;4、pUC质粒载体〔包括四个局部〕：

来自pBR322质粒的复制起点〔ori〕

氨苄青霉素抗性基因〔ampr〕

大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因〔lacZ〕启动子及编码α-肽链的DNA序列。特称为lacZ’基因

位于lacZ’基因5’-端的一段多克隆位点〔MCS〕，外源基因插入破坏lacZ’基因功能;优点：

更小的分子量和更高的拷贝数。在pBR322根底上构建pUC质粒载体时，仅保存下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点，其分子小了许多，pUC8为2750bp，pUC18为2686bp。由于缺失rop基因，pUC质粒不经氯霉素扩增时，平均每个细胞即可达500~700个拷贝。;ColE1质粒DNA复制起始部位调控因子之间关系;前体RNA(RNAII)的转录起始于复制起点上游，需经RNaseH加工后产生有555个核苷酸的引物，起始DNA合成。

RNA1在RNA2的5’末端，转录方向相反，因此能通过氢键配对与后者相互作用，阻止RNaseH加工RNA2，使其不能转化为有活性的引物