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HIS-TAG蛋白质的表达纯化
4.?WashingBuffer:100mMNaH2PO4,10mMTris,8MUrea,pH6.3。
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5.?ElutionBuffer:100mMNaH2PO4,10mMTris,8MUrea,500mMImidazole,pH8.0。
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6.?IPTG:100mMIPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):2.38gIPTG溶于100mlddH2O中,0.22μm滤膜抽滤,-20℃保存。
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二、获得目的基因
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1.?通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。
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2.?通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA为模板,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
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三、构建重组表达载体
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1.?载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
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2.?PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
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四、获得含重组表达质粒的表达菌种
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1.?将连接产物转化大肠杆菌DH5α,根据重组载体的标志(抗Amp或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。
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2.?测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
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3.?以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
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五、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导
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1.?接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mLLB液体培养基中(含100ug/mL氨苄青霉素),37℃震荡培养过夜。
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2.?按1∶50或1:100的比例稀释过夜菌,一般转接1mL过夜培养物于100mL(含100ug/mL氨苄青霉素)LB液体培养基中,37℃震荡培养至OD600?=0.6-0.8(最好0.6,大约需3h)。取10ul样品用于SDS分析。
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3.?对照组不加诱导剂,实验组加入IPTG至终浓度0.5mmol/l,37℃继续培养1-3h。
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4.?12000rpm离心10min,弃上清,菌体沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。
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六、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离、纯化
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1.?NTA层析柱的准备:在层析柱中加入1mLNTA介质,并分别用8mL去离子水,8mL上样缓冲液洗涤。
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2.?重组蛋白的变性裂解:在冰浴中冻融菌体沉淀,加入5mL上样缓冲液,用吸管抽吸重悬,超声波破裂菌体,用振荡器等轻柔的混匀样品60min,4℃12000rpm离心30min,将上清吸至一个干净的容器中,并弃沉淀。取10ul上清样品用于SDS分析。
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3.?上清样品以10-15mL/h流速上Ni2+-NTA柱,收集流出液,取10ul样品用于SDS分析。
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4.?洗脱杂蛋白:用WashingBuffer以10-15mL/h流速洗柱,直至OD280?=0.01分步收集洗脱液,约3-4h,取10ul洗脱开始时的样品用于SDS分析。
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5.?洗脱目标蛋白:用ElutionBuffer洗柱,收集每1mL级分,分别取10ul样品用于SDS分析。
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