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HIS-TAG蛋白质的表达纯化
4.?WashingBuffer：100mMNaH2PO4，10mMTris，8MUrea，pH6.3。
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5.?ElutionBuffer：100mMNaH2PO4，10mMTris，8MUrea，500mMImidazole，pH8.0。
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6.?IPTG：100mMIPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38gIPTG溶于100mlddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
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二、获得目的基因
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1.?通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
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2.?通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
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三、构建重组表达载体
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1.?载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
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2.?PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
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四、获得含重组表达质粒的表达菌种
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1.?将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
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2.?测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
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3.?以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
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五、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导
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1.?接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mLLB液体培养基中（含100ug/mL氨苄青霉素），37℃震荡培养过夜。
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2.?按1∶50或1：100的比例稀释过夜菌，一般转接1mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600?=0.6-0.8（最好0.6，大约需3h）。取10ul样品用于SDS分析。
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3.?对照组不加诱导剂，实验组加入IPTG至终浓度0.5mmol/l，37℃继续培养1-3h。
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4.?12000rpm离心10min，弃上清，菌体沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。
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六、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离、纯化
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1.?NTA层析柱的准备：在层析柱中加入1mLNTA介质，并分别用8mL去离子水，8mL上样缓冲液洗涤。
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2.?重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融菌体沉淀，加入5mL上样缓冲液，用吸管抽吸重悬，超声波破裂菌体，用振荡器等轻柔的混匀样品60min，4℃12000rpm离心30min，将上清吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。取10ul上清样品用于SDS分析。
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3.?上清样品以10-15mL/h流速上Ni2+-NTA柱，收集流出液，取10ul样品用于SDS分析。
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4.?洗脱杂蛋白：用WashingBuffer以10-15mL/h流速洗柱，直至OD280?=0.01分步收集洗脱液，约3-4h，取10ul洗脱开始时的样品用于SDS分析。
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5.?洗脱目标蛋白：用ElutionBuffer洗柱，收集每1mL级分，分别取10ul样品用于SDS分析。
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