代谢物酶法分析技术.pptx

代谢物酶法分析技术代谢物酶法分析技术第1页

2代谢物酶法分析技术是指用酶法分析方法来测定人体內代谢物或代谢产物技术。酶法分析（enzymaticmethod）是以酶为试剂测定酶促反应底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及利用酶促反应测定酶活性一类方法。代谢物酶法分析技术概念代谢物酶法分析技术第2页

3代谢物酶法分析平衡法（终点法）速率法（动力学法）代谢物酶法分析理论基础1代谢物酶法分析技术第3页

4平衡法是指标本中待测物量有限，经过酶促反应逐步被消耗，当剩下底物量很小（1%～5%）时，指示反应信号逐步到达平衡，即通常所说终点，所以又称为终点法(end-pointmethod)。平衡法特点是测定底物总改变量，即测定是“浓度”。平衡法基础理论(1)代谢物酶法分析技术第4页

5速率法(rateassay)又称动力学法、连续监测法，测定是速率（通常指是初速度），依据是当底物消耗量较小时(5%)，酶促反应呈一级反应，此时反应速度（v）与代测物浓度成正百分比。速率法关键是怎样使酶促反应成一级反应。速率法基础理论(2)代谢物酶法分析技术第5页

6在临床操作中，只要测定时间待测物消耗5%，只要测定两个固定时间吸光度差值，就能够采取标准浓度对照法计算样本浓度，这种方法又称为固定时间法(fixedassay)。速率法基础理论(2)代谢物酶法分析技术第6页

7平衡法开始一段时间都有可能遵照一级反应规律。相反，速率法只要时间足够长，也会到达平衡。对于平衡法来说关键是确定到达平衡所需时间。对于速率法来说关键是怎样使酶促反应成一级反应。平衡法与速率法相互联络返回章目录代谢物酶法分析技术第7页

8酶作用特异性高，血清等体液样品不需预处理就能测定，简化了试验程序；试剂酶大多是蛋白质，没有毒性，防止了化学品对环境污染；酶促反应温和，制成试剂盒可适合用于自动分析。代谢物酶法分析主要优点代谢物酶法分析在准确性、精密度、灵敏度和线性测定范围等方面都优于传统化学法代谢物酶法分析方法2代谢物酶法分析技术第8页

9待测物与产物在理化性质上有便于检测信号，如吸收光谱不一样则可直接测定待测物或产物本身信号改变来进行定量分析方法称为直接法。单酶反应直接法(1)代谢物酶法分析技术第9页

10单底物反应直接测定法尿酸+O2+H2O尿囊素+CO2+H2O2胆绿素+H2O胆红素+O2尿酸在293nm处有吸收，而尿囊素没有吸收，在293nm处测定吸光度下降胆红素在450nm处有吸收，而胆绿素没有吸收，在450nm处测定吸光度下降尿酸紫外法测定胆红素测定代谢物酶法分析技术第10页

11双底物反应直接测定法对于双底物反应，为了便于试验分析，在试验设计时普通将所加另一个底物浓度设计得相当大，即[S2]Km2，这时酶促反应动力学可按单底物法处理，整个反应只与待测物相关，呈一级反应动力学。但在以NADH或NADPH为底物终点法测定中，因340nm吸光度限制，辅酶用量不可能过高。代谢物酶法分析技术第11页

12在340nm处测定吸光度增加来进行定量方法乳酸测定双底物反应直接测定法乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+丙酮酸测定在340nm处测定吸光度下降来进行定量方法乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+代谢物酶法分析技术第12页

13酶促反应底物或产物假如没有可直接检测成份，将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而到达检测目标方法称酶促偶联法。最常见偶联指示系统有两个：一个是脱氢酶指示系统，另一个为过氧化物酶指示系统。酶偶联法(2)代谢物酶法分析技术第13页

14脱氢酶指示系统氧化型辅酶NAD(P)+在340nm处没有吸收峰,还原型辅酶NAD(P)H在340nm处有吸收峰.代谢物酶法分析技术第14页

15脱氢酶指示系统以脱氢酶为指示酶系统测定是氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)或氧化型辅酶Ⅱ(NADP+)变为还原型NAD(P)H后在340nm处吸光度增高来计算出被测物浓度，也可利用脱氢酶逆反应，将还原型NAD(P)H变为氧化型NAD(P)+，测定340nm处吸光度下降来计算被测物浓度。代谢物酶法分析技术第15页

16脱氢酶指示系统血清葡萄糖己糖激酶法测定Glu+ATPG-6-P+ADPG-6-P+NADP+P-6-GA+NADPH+H+指示酶反应将NADP+转化为NADPH+H+，测定340nm吸光度上升速度与葡萄糖含量成正比代谢物酶法分析技术第16页

17脱氢酶指示系统血清尿素测定尿素+H2O2NH3+CO2NH3+α-酮戊二酸+NADH+H+谷氨酸+H2O+