基因工程重组体克隆的筛选和鉴定.pptx

基因工程重组体克隆的筛选和鉴定基因工程重组体克隆的筛选和鉴定第1页

一、抗药性标识及其插入失活选择法pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因:Tetr和Ampr。Tetr上有插入位点BamHI和SalI;Ampr上有插入位点PstI。第一节载体表型选择法1.原理：基因工程重组体克隆的筛选和鉴定第2页

pBR322基因工程重组体克隆的筛选和鉴定第3页

（1）四环素：（2）氨苄青霉素抗性基因：2.pBR322抗菌素标识选择产生?-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。抑制细菌生长，但不杀死细菌。杀死生长细菌，但不杀死停顿生长细菌。（3）环丝氨酸：基因工程重组体克隆的筛选和鉴定第4页

3.选择过程：假如在Tetr上插入外源DNA，造成四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。Tetr失活菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。（1）四环素抗性插入失活基因工程重组体克隆的筛选和鉴定第5页

无环丝氨酸培养基基因工程重组体克隆的筛选和鉴定第6页

（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程假如Ampr上插入外源DNA，造成氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。基因工程重组体克隆的筛选和鉴定第7页

二、?-半乳糖苷酶显色反应选择法?-半乳糖苷酶乳糖半乳糖葡萄糖Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛蓝++深蓝色1.原理：载体上有一段?-半乳糖苷酶基因（LacZ）?片段（氨基端），其上有外源DNA插入位点。受体菌基因组中有突变?-半乳糖苷酶基因（?片段缺失）。能够被IPTG诱导表示。载体和受体菌基因组能够互补形成完整有功效?-半乳糖苷酶。基因工程重组体克隆的筛选和鉴定第8页

假阳性：假如插入外源DNA恰好是3倍数而且没有中止密码；（不破坏?肽）。2.选择过程基因工程重组体克隆的筛选和鉴定第9页

?-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。基因工程重组体克隆的筛选和鉴定第10页

利用插入外源基因表示产物特征进行直接选择。（只在特定条件下）。转化进来外源基因产物能够填补受体菌株突变型缺点。一、原理：第二节依据插入基因表型选择1.填补缺点his-his+受体菌：外源基因：在不含组氨酸培养基中生长基因工程重组体克隆的筛选和鉴定第11页

小鼠二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。DHFR载体连接转化受体菌三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板含DHFR克隆才能生长例：使被转化受体菌表现出外源基因表型。2.增加新性状基因工程重组体克隆的筛选和鉴定第12页

利用有插入片段重组载体分子量比野生型载体分子量大。一、直接电泳检测法从转化后菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。第三节DNA电泳检测法分子量Marker载体重组克隆基因工程重组体克隆的筛选和鉴定第13页

二、酶切电泳筛选法1.原理：依据已知外源DNA序列限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。或用适当内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计结果。基因工程重组体克隆的筛选和鉴定第14页

ABA或B基因工程重组体克隆的筛选和鉴定第15页

基因工程重组体克隆的筛选和鉴定第16页

不一样克隆酶切结果基因工程重组体克隆的筛选和鉴定第17页

筛选过程基因工程重组体克隆的筛选和鉴定第18页

三、PCR扩增检测法1.原理PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。2.过程（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。（2）用外源DNA插入片断引物作PCR。（3）电泳PCR产物。（4）检验是否有PCR产物。（5）PCR产物长度是否与外源基因一致。基因工程重组体克隆的筛选和鉴定第19页

1.核酸杂交第四节核酸杂交检测法一、原理：重组克隆与探针杂交。3.识别标识32P或125I。（1）放射性同位素2.检测用探针与外源DNA插入片断互补序列。（2）非放射性标识荧光素基因工程重组体克隆的筛选和鉴定第20页

二、核酸杂交检测方法用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。1.Southernblotting从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），再用探针杂交。只有带有插入片断重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。基因工程重组体克隆的筛选和鉴定第21页

酶切前酶切后插入片断载体基因工程重组体克隆的筛选和鉴定第22页

Southernblot筛选结果基因工程重组体克隆的筛选和鉴定第23页

（1）原位杂交筛选特点：对应菌斑或噬菌斑位置不变，能够直接找出阳性菌落。基因工程重组体克隆的筛选和鉴定第24页

基因工程重组体克隆的筛选和鉴定第25页

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