青霉素酰化酶的分离纯化.ppt

结论第92页,共97页，星期六，2024年，5月Thatisall.Thankyou.第93页,共97页，星期六，2024年，5月第94页,共97页，星期六，2024年，5月第95页,共97页，星期六，2024年，5月制备6-APA临床上直接应用的天然青霉素是青霉素G和青霉素V，其它青霉素均为对6-APA进行修饰得到的半合成青霉素。因此高效制备6-APA是生产半合成青霉素工艺中重要的一环。6-APA第96页,共97页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第97页,共97页，星期六，2024年，5月填料的电镜图第60页,共97页，星期六，2024年，5月结论第61页,共97页，星期六，2024年，5月疏水性电荷诱导色谱疏水性电荷诱导色谱：疏水性电荷诱导色谱是一种通过可离子化的对偶式配基对pH依赖性，来分离生物大分子的新型液-固吸附性色谱技术。其吸附是通过温和疏水作用，并在近生理条件下发生，不需邮寄溶剂或其他盐类的加入。解吸是通过调节流动相的pH值，使配基与目的产物带上相同电荷，当静电斥力大于疏水性相互作用时，洗脱便开始了。第62页,共97页，星期六，2024年，5月第63页,共97页，星期六，2024年，5月疏水性电荷诱导色谱纯化青霉素酰化酶D.Coulon等以4-MEP为填料，利用疏水性电荷诱导色谱分离青霉素酰化酶第64页,共97页，星期六，2024年，5月传统色谱在分离青霉素酰化酶中的应用与新型色谱一样，从传统色谱出发可以开发出好的分离青霉素酰化酶的工艺第65页,共97页，星期六，2024年，5月拟亲和色谱拟亲和层析法：指用固定的配体选择性吸附一些酶或其它蛋白的层析技术。第66页,共97页，星期六，2024年，5月拟亲和色谱分离青霉素酰化酶RustemKecili等以Poly(EGDMA-MAAP)为配基，进行拟亲和色谱纯化青霉素酰化酶。结论青霉素酰化酶纯化倍数为23.2青霉素酰化酶回收率为93%第67页,共97页，星期六，2024年，5月一步离子交换纯化青霉素酰化酶传统的分离纯化工艺一般需要两步或两步以上操作。而每次操作都会有产物损伤，因此如何减少分离步骤是提高产率的一条思路。ValerieOrr等提出了一个只需一步离子交换色谱即可完成对青霉素酰化酶分离纯化的工艺。如下表，他们采用一种电导率低的培养基培养能产生青霉素酰化酶的大肠杆菌第68页,共97页，星期六，2024年，5月实验方法开发合适的培养基培养大肠杆菌至适当时间后取出适量培养基，离心除去细胞。将适量上清液上样于离子交换柱（QSepharoseTMFastFlowColumn）探索最佳工艺。用280nm紫外检测。收集各区段进行SDS检测。第69页,共97页，星期六，2024年，5月有图可见，青霉素酰化酶没有吸附到色谱柱上而杂蛋白大部分被色谱柱吸附第70页,共97页，星期六，2024年，5月结论纯化的青霉素酰化酶的酶活为16.3U/mg青霉素酰化酶的纯度提高了3倍第71页,共97页，星期六，2024年，5月其它方法离子交换膜色谱双水相萃取高通量筛选辅助设计分离纯化工艺第72页,共97页，星期六，2024年，5月膜色谱技术膜色谱是将液相色谱与膜分离融合于一起的新型生化分离技术，具有选择性高、分离速度快、能耗低、易放大等特点。膜色谱可分为四类：亲和膜色谱，离子交换膜色谱，疏水作用膜色谱，多级膜色谱。第73页,共97页，星期六，2024年，5月离子交换膜色谱离子交换膜色谱：离子交换膜色谱主要是利用膜介质表面的离子交换基团与目标蛋白之间的离子交换作用进行分离的根据离子交换基团的性质，可分为强阳离子型、弱阳离子型、强阴离子型、弱阴离子型。第74页,共97页，星期六，2024年，5月离子交换膜色谱的特点操作条件较温和使用寿命长选择性差第75页,共97页，星期六，2024年，5月离子交换膜色谱分离青霉素酰化酶ValerieOrr等开发了集膜分离与离子交换色谱于一体的离子交换膜，用来分离青霉素酰化酶。第76页,共97页，星期六，2024年，5月部分实验结果A离子交换膜的洗脱曲线；B各洗脱区段的SDS检测第77页,共97页，星期六，2024年，5月结论青霉素酰化酶的产量达到19U/mg青霉素酰化酶的回收率达到72%第78页,共97页，星期六，2024年，5月双水相萃取原理：某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可以形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即形成双水相系统（aqueoustwo-phasesyst