重组体的筛选与鉴定.ppt

2.几种报道基因的作用原理4-甲-β-D-葡糖醛酸荧光产物GUSGFP紫外光照发绿色荧光5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖醛酸蓝色水解产物GUS第95页,共99页，星期六，2024年，5月FirefliesemitlightcatalyzedbyluciferasewithATP第96页,共99页，星期六，2024年，5月转入萤火虫的luciferase的烟草第97页,共99页，星期六，2024年，5月烟草叶片表达B型肝炎抗原第98页,共99页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第99页,共99页，星期六，2024年，5月（2）Westernblotting电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）。①Western（转膜）胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。膜胶蛋白第63页,共99页，星期六，2024年，5月Western装置第64页,共99页，星期六，2024年，5月②Blotting原理与ELISA相同。待测蛋白硝酸纤维素膜一抗二抗辣根过氧化物酶底物产物，并发出光PAGE胶待测蛋白底片曝光辣根过氧化物酶：HRPO第65页,共99页，星期六，2024年，5月第66页,共99页，星期六，2024年，5月1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与膜上的蛋白结合。2）洗去未结合的一抗。3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。4）清洗掉未结合的二抗。5）用HRPO的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，冲洗胶片。③Blotting过程ImmunoBlotting第67页,共99页，星期六，2024年，5月④结果多克隆抗体Blotting的结果单抗blotting结果第68页,共99页，星期六，2024年，5月转译筛选法有两种:

杂交选择转译（hybridselectedtranslation,HART)

杂交抑制转译(hybridarreatedtranslation,HRT)。

转译筛选法的突出优点是将克隆的DNA同所编码的蛋白质产物之间的关系对应起来。

第六节转译筛选法借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。第69页,共99页，星期六，2024年，5月一、无细胞翻译系统无细胞系统cell-freesystem指保留蛋白质生物合成能力的细胞抽取物。无细胞系统要包含以下成分：核糖体、各种tRNA、各种氨酰-tRNA合成酶、蛋白质合成需要的起始因子和延伸因子以及终止释放因子、GTP、ATP、20种基本的氨基酸。常见的无细胞翻译系统有：大肠杆菌无细胞翻译系统、兔网织红细胞无细胞翻译系统、麦胚无细胞翻译系统和某些肿瘤细胞制备成的无细胞翻译系统。适用于mRNA转录丰度高的外源基因。第70页,共99页，星期六，2024年，5月二、转译筛选mRNA无细胞翻译系统35S标记的甲硫氨酸翻译35S标记的肽链PAGE电泳放射自显影比较放射性带纹的位置载体+外源DNA转录与预期的产物分子量相符？第71页,共99页，星期六，2024年，5月三、杂交抑制转译法mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。单链mRNA核糖体小亚基核糖体大亚基能翻译mRNADNA核糖体小亚基核糖体大亚基不能翻译1.原理第72页,共99页，星期六，2024年，5月2.过程第73页,共99页，星期六，2024年，5月四、杂交释放转译法1.原理：在高甲酰胺溶液中载体上克隆的cDNA与它的mRNA杂交吸附，然后洗脱，释放出与它对应的mRNA，进行体外转录。研究其转录产物的性质是否是预期的基因产物（如分子量、免疫源性等）。第74页,共99页，星期六，2024年，5月2.过程硝酸纤维素滤膜载体和插入的cDNA总mRNAcDNA基因的mRNA杂交洗脱cDNA基因的mRNA体外翻译cDNA编码的蛋白电泳凝胶放射自显影cDNA编码的蛋白硝酸纤维素滤膜载体和插入的cDNA硝酸纤维素滤膜载体和插入的cDNA收集35S标记的氨基酸第75页,共99页，星期六，2024年，5月专门设计检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。待测蛋白质硝酸纤维素滤膜能与蛋白质结合的DNA序列放射性标记待测蛋白质硝酸纤维素滤膜能与蛋