粪便病原菌的分离与鉴定.ppt

*实验目的?粪便标本中常含有很多杂菌，应根据检验目的菌的不同而选择培养基，以利于病原菌的检出。而且，因其各种正常菌群含量甚多，仅以染色性和形态无法分辨是否为病原菌。常见的病原菌有志贺氏菌属、致病性大肠杆菌属、弧菌属、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、艰难梭菌等。这次实验中我们从粪便标本中检出的是大肠埃希菌、痢疾志贺菌。而且，我们从这次的综合性实验中了解到了医学微生物学主要的研究方法和手段，掌握了微生物试验的基本技能和基本原理，树立了牢固的无菌观念。同时培养了我们的动手能力和表达能力。*粪便标本直接粪便检查革兰染色单染色动力观察及制动试验初步结果报告需氧培养增菌培养直接分离碱性胨水碱性平板分离菌落形态抗血清凝集生化反应增菌液菌落形态抗血清凝集生化反应SS平板副溶血性弧菌选择性平板菌落形态生化反应厌氧培养微需氧培养及特殊培养实验结果*1.实验材料接种针、接种环、油性笔、打火机、试管架、普通冰箱、冷藏室、隔水式电热恒温培养箱、奥林巴斯CX21型生物显微镜、1500W电炉、蒸馏水、玻片缸、消毒液、1‰新洁而灭、天平、砝码、细菌干粉培养基（营养琼脂、营养肉汤、半固体琼脂）、锥形瓶、量筒、试管筐、糖发酵微量管（葡萄糖、乳糖）、灭菌平皿、试管（棉塞）、刻度吸管、洗耳球、称量纸、硫酸纸、牛皮纸、橡皮筋、尺子、药勺、革兰氏染色液（结晶紫染液、卢戈碘液、95％乙醇、稀释石炭酸复红）、小砂轮、痢疾血清、青霉素、链霉素、庆大霉素和生理盐水滤纸片、线绳、香柏油、擦油纸*2.实验方法2.1培养基的制备、消毒和灭菌培养基制备的一般程序：调配→溶化→矫正pH→分装→灭菌→检定→保存。干粉培养基→蒸馏水→加热溶化→分装→灭菌→检定→保存。干粉培养基→蒸馏水→加热溶化→分装→集中放在试管筐里，然后罩上硫酸纸，牛皮纸，用橡皮筋扎好→放入讲台边的高压灭菌桶或高压灭菌筐内→送到高压灭菌室（洗刷室）。*表1.培养基的制备组号培养基称量(g)水量(ml)煮沸(次)分装(ml)备注(24人分)1营养琼脂11.43003瓶，500ml瓶，平板2,3营养琼脂2.9753515支，中试管，斜面6营养肉汤2.0901330支，小试管，液体7,8半固体1.5503315支，小试管，高层*2.2细菌的分离与培养2.2.1采用平板划线分离法，将取粪便标本中混杂的多种细菌，在伊红美蓝固体培养基表面划线，使之分散成单个细菌，在37℃培养24h，从而分离出肉眼可见的单个菌落。2.2.2细菌在固体培养基上生长特征的观察。观察形成菌落的大小、形状、边缘、表面、溶血性、色素、透明度、湿润度。2.2.3细菌的纯培养。粪便标本在伊红美蓝平板上，有紫黑色、粉红色两种菌落。挑选这两种不同菌落分别在斜面培养基上接种，标记，在37℃培养18h。2.2.4细菌在斜面培养基上生长特征的观察。观察细菌的生长量、菌苔形状、表面形状、光泽、透明度、颜色等。2.2.5液体培养基接种法。用接种环在固体或斜面培养基上挑选紫黑色和粉红色菌苔少许移入液体培养基管中，在接近液面的管壁上轻轻研磨，并沾取少量肉汤调和，使菌液混合于培养基中，混匀。在35℃培养4~6h，观察细菌的生长情况*2.3细菌个体形态特征的观察2.3.1取两块玻片，在每块玻片上加生理盐水3～4ul，2滴，在斜面培养基上取紫黑色菌苔少许（1mm小菌落的半量）与第一块玻片上的一滴盐水混匀，再取粉红色菌苔少许（1mm小菌落的半量）与第二块玻片上的一滴盐水混匀，涂成1cm2；做好标志。经在空气中干燥后，再用酒精灯对其进行固定。2.3.2革兰染色。用结晶紫对以上两块已固定的玻片进行初染1分钟，水洗；再用卢戈碘液媒染1分钟，水洗；然后用95％乙醇对其进行脱色约20秒钟，水洗；最后用稀释复红复染1分钟，水洗；吸干，在显微镜下镜检。*2.4细菌生化反应鉴定2.4.1糖发酵试验。用接种针分别挑少许紫黑色和粉红色的细菌接种到葡萄糖发酵微量管和乳糖发酵微量管中，将微量管放在平皿盖内，在37℃下，培养24小时，观察