细菌基因组DNA的提取.pptxVIP

分离纯化核酸总标准：

①应确保核酸一级结构完整性；

②排除其它分子污染。

核酸纯化应到达要求：

①核酸样品中不应存在有机溶剂和过高浓度金属离子；

②其它生物大分子污染应降低到最低程度；

③排除其它核酸分子污染。;核酸制备时应注意事项:

①尽可能简化操作步骤，缩短提取时间。

②降低化学原因对核酸降解。

③降低物理原因对核酸降解：机械剪切力和高温

④预防核酸生物降解。;核酸制备步骤：

;核酸酶抑制和抑制剂

降低温度，改变pH及盐浓度，都利于对核酸酶活性抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更加好。

对于DNA，抑制DNase活力很轻易，但预防机械张力拉断则更主要。

对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更主要。;DNase抑制

①加入少许金属离子螯合剂，如0.01mol/LEDTA或柠檬酸钠，DNase基本能够全部失活。

②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。;RNase抑制

①操作要带手套。

②全部器皿要严格消毒，

③试剂处理

④低温操作

⑤在分离过程中要加入一定RNase抑制剂。;核酸制备中惯用去垢剂

核酸本身带负电荷，结合带正电荷蛋白质。用于核酸提取去垢剂，普通都是阴离子去垢剂，去垢剂作用：

1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；

2．溶解核小体上蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；

3．对RNase、DNase有一定抑制作用。;核酸制备中惯用蛋白质变性剂

1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。

2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。

3.一些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞作用。

;核酸制备中惯用酶

DNase

RNase

蛋白酶K

溶菌酶

;

;细胞破碎

机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；

化学试剂法：用SDS处理细胞；

酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。

DNA提取

SDS（十二烷基硫酸钠）法：SDS是有效阴离子去垢剂,细胞???DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,SDS能够破坏这种价键。

CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法：CTAB是一个阳离子去垢剂，它能够溶解膜与脂膜，使细胞中DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。

DNA纯化（去杂质）

蛋白质：惯用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。

RNA：常选取RNase消化，或是用LiCl来消除大分子RNA。

酚类物质：提取液中加少许巯基乙醇，选取幼嫩材料。

多糖：提取液中加1％PVP。

;核酸样品保留

温度：

4℃（5℃）最正确和最简单

-70℃是长久保留良好温度，为一次性保留

-20℃保留

保留介质：

TE缓冲溶液(最惯用)

10mmol/LTris-ClpH8.0

1mmol/LEDTApH8.0;二、材料、设备及试剂;1、培养5ml细菌培养物至饱和状态，取1.2ml培养物离心1rpm,1min。

2、沉淀物加入570ul无菌水（或TE）缓冲液，用吸管重复吹打使之重悬。加入30ul10%SDS和10ul20mg/ml蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h，（加入3ul溶菌酶50mg/ml效果更加好）。

3、加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀，于60℃温育10min。(上下颠倒混匀)，离心，1rpm,5min。

4、取上清，加入等体积（约800ul）酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），混匀，离心1rpm,5min，将上清液转至新管中。（抽提两次）

5、加入0.6体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，静止10分钟，离心,1rpm,10min。

6、沉淀用1ml75%乙醇中洗涤，离心5min，弃上清液，重悬于30ul无菌水（或TE）缓冲液。;四、注意事项——材料准备;四、注意事项——细胞裂解;四、注意事项——核