蛋白质的分离和纯化.ppt

洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。凝胶色谱柱的装填50cm高第32页,共43页，星期六，2024年，5月样品加入与洗脱①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。④洗脱：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）第33页,共43页，星期六，2024年，5月1、在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因()A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果B、气泡阻碍蛋白质的运动C、气泡与蛋白质发生化学反应D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密A第34页,共43页，星期六，2024年，5月2、样品的加入和洗脱的操作不正确的是A加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面B．加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内C．等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口D．用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面A第35页,共43页，星期六，2024年，5月4.纯度鉴定---SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳第36页,共43页，星期六，2024年，5月

蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白释放；分离血红蛋白溶液。（2）粗分离：薄膜透析法除去分子较小的杂质。（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。（4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。（以血红蛋白的分离纯化为例）三、蛋白质提取分离的程序第37页,共43页，星期六，2024年，5月1、下列关于DNA和血红蛋白的提取与分离属于的叙述中，错误的是()A.可用蒸馏水涨破细胞的方法从猪红细胞中提取到DNA和蛋白质B.用不同浓度的NaCl溶液反复溶解于析出DNA可去除部分杂质C.透析法分离蛋白质的依据是利用蛋白质不能通过半透膜的特性D.进一步分离与纯化血红蛋白可用凝胶色谱法、离心法、电泳法等A第38页,共43页，星期六，2024年，5月2、下列关于血红蛋白提取和分离实验中样品处理步骤的描述，正确的是()A.红细胞的洗涤：加入蒸馏水，缓慢搅拌，低速短时间离心B.血红蛋白的释放：加入生理盐水和甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌C.分离血红蛋白：将搅拌好的混合液离心、过滤后，用分液漏斗分离D.透析：将血红蛋白溶液装入透析袋，然后置于pH为4.0的磷酸缓冲液中透析12hC第39页,共43页，星期六，2024年，5月3、以下关于血红蛋白提取和分离的过程及原理叙述正确的是()A.红细胞洗涤过程中要加入5倍体积的蒸馏水，重复洗涤三次B.将血红蛋白溶液放在质量分数为O.9％的NaCl溶液透析12小时C.凝胶装填在色谱柱内要均匀，不能有气泡存在D.蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较大的移动速度慢C第40页,共43页，星期六，2024年，5月4、在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是 ()A.防止血红蛋白被O2氧化B.血红蛋白是一种碱性物质，需要酸中和C.磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程D.让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能D第41页,共43页，星期六，2024年，5月5、下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的处理措施中，错误的是（）A.采集血样后要高速短时间离心获得血细胞B.洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则血浆蛋白无法除净。C.在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释放出血红蛋白D.释放血红蛋白后再经过离心，就可以使血红蛋白和其他杂质分离开来A第42页,共43页，星期六