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ＳＳ熊胆眼药水刺激性研究

摘要:目的:构建滴眼液刺激性体外评价方法,筛查SS熊胆眼药水刺激性原

因并采取适宜方法解决。方法:采用兔角膜上皮细胞毒性试验(SIRC-MTT)对4种

熊胆滴眼液进行评价,将结果与临床刺激性评分进行相关性分析,运用SIRC-MTT

筛查SS熊胆眼药水的刺激性原因并进行解决。结果:相关系数为0.961,说明

SIRC-MTT能较好评价熊胆滴眼液眼刺激性;造成熊胆眼药水刺激性较强的原因

为羟苯乙酯与熊胆原液的共存;采用减少羟苯乙酯用量(调整至0.04%)、添加羧甲

基纤维素钠(0.2%~0.25%)均能增加角膜上皮细胞存活率。结论:SIRC-MTT是SS

有效的体外刺激性评价方法;降低羟苯乙酯用量和添加羧甲基纤维素钠均能降低

熊胆眼药水的刺激性。

关键词:刺激性;熊胆眼药水;细胞毒性试验;角膜上皮细胞

SS熊胆眼药水由熊胆单味中药研制而成,具有清热解毒,祛翳明目的功效,主

要用于治疗急、慢性卡他性结膜炎,但大多患者在使用中发现该药具有较强刺激

性,严重影响了其临床用药。现今评价眼刺激性的方法为兔眼刺激法(draizetest),

该法具有主观性强,实验差异大等缺点[1],难以寻找出SS熊胆眼药水刺激性较强

的内在原因。该研究拟建立SS新的体外刺激性评价方法,用于筛查该眼药水的刺

激性原因,并解决该问题。

1材料与方法

1.1受试物、仪器与试剂

SS熊胆眼药水(成都某药业公司提供),熊胆粉滴眼液(某药业公司),熊胆黄芩

滴眼液(黑龙江黑宝药业),复方熊胆滴眼液(长春普华药业),熊胆、羟苯乙酯、羧甲

基纤维素钠(成都某药业公司提供),氯化钠、硼酸、硼砂(科龙试剂有限公司),透明

质酸钠(Solarbio);二氧化碳培养箱(Thermo),超净工作台(苏州净化),倒置显微镜

(奥林巴斯),自动酶标仪(BIO-RAD),DMEM低糖(GIBCO,USA),胎牛血清(甘肃民

海),MTT(SIGMA,USA),F12(GIBCO,USA),青霉素(石家庄制药有限公司),链霉素

(华北制药股份有限公司),L-谷氨酰胺DMSO(SIGMA,USA)。培养基组成(20%胎

牛血清,F12培养基∶DMEM低糖=3∶1,2mM/100mL谷氨酰胺,100U/mL双抗溶

液)。

1.2动物

健康白种家兔,雌雄不限,体重2500±200g,成都中医药大学动物实验中心提

供。

1.3兔角膜上皮细胞的培养[2,3]

健康白种家兔,断头放血处死后,无菌条件下摘取眼球,104U·L-1青链霉素溶

液漂洗2次,,取角膜缘部上皮组织:沿角巩膜缘灰白交界后1mm处穿刺,取下包括

1mm巩膜缘的眼前段组织,解剖镜下去除晶状体、虹膜等附属组织,将得到的角膜

组织逐个撕取角膜内皮及后弹力层,然后沿透明角膜内1mm,环状取下2～2.5mm

宽的角膜缘组织,剪成1mm×1mm×1mm大小;将组织块平铺于培养瓶中,置37℃、

5%CO2恒温培养箱中培养,3d首次换液,以后隔日换液。原代培养至80%融合

后,0.25%胰酶消化传代,3d后首次换液,以后隔日换液,直至细胞融合。传代细胞

(2-4代)用于实验研究。将实验用细胞以104个/孔细胞接种于96培养板中,培养

(37℃、5%CO2)5d,细胞达到铺平状态。

1.4评价方法的建立

1.4.1市售滴眼液刺激性评价

对市售4种熊胆滴眼液临床用药状况进行分析,其刺激性评价结果见表1。

1.4.2体外刺激性评价方法

(1)直接接触法[4]。将培养液吸出,加入不同滴眼液溶液100μL作用20min,

吸出滴眼液,PBS冲洗两次,加入含10%胎牛血清培养基

180μL,20μLMTT(5mg/mL),37℃孵育4h,吸出培养基,加入150μLDMSO,570nm酶

标仪测定吸光度。

(2)混合培养法[5]。将培养液吸出,加入含40μL的滴眼液样品的培养基继续

培养24h,然后吸出含样品