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项目编号
附件2：
北京林业大学
国家级大学生创新创业训练计划
创新训练项目申请书
项目名称：
栓皮栎组培再生体系的构建及原生质体游离研究
主持人：
宋少宇
专业年级
生科10
联系电话：指导教师：
王君
职称
副教授
学院
生物科学与技术学院
起止年月：
2012年1月—2013年12月
申请日期：
2012年4月20日
北京林业大学
一、项目基本情况
项目简介
项目名称
栓皮栎组培再生体系的构建及原生质体游离研究
项目类别
√理工农类□经管文法类
申请经费
（元）
30000
起止年月
2012年1月——2013年12月
主持人
姓名
性别
学号
专业年级
联系电话
电子邮箱
宋少宇
女
100414217
生科10angela-song@
项目组其他成员
姓名
性别
学号
专业年级
所在学院
项目分工
李昌磊
男
100414203
生技10-2
生物科学与技术学院
组培再生体系研究
曾青青
女
100414226
生科10
生物科学与技术学院
组培再生体系研究
郭倩
女
100114118
林学10-1
林学院
原生质体游离研究
尚峰男
男
100414204
生科10
生物科学与技术学院
原生质体游离研究
指导教师
姓名
性别
年龄
职称
职务
所在学院
王君
男
30
副教授
生物科学与技术学院
研究方向
林木倍性育种及细胞遗传学
联系电话电子邮箱
wangjun@
三、项目研究内容
（一）项目研究内容（限600字）
1、栓皮栎愈伤组织的诱导和继代研究
分别以栓皮栎无菌茎段、叶片和叶柄为材料，对愈伤组织诱导培养基的外源生长调节剂种类及配比进行筛选，诱导产生愈伤组织，并筛选适宜的愈伤组织继代培养基和培养条件。
2、栓皮栎愈伤分化及植株再生研究
以栓皮栎愈伤组织为材料，筛选愈伤组织分化出芽的适宜培养基及其外源生长调节剂配比，并进一步开展生根适宜培养基的筛选，建立栓皮栎植株组培再生技术体系。
3、栓皮栎叶肉和愈伤组织原生质体游离研究
以栓皮栎无菌苗叶片和愈伤组织为材料，开展栓皮栎叶肉原生质体和愈伤组织原生质体游离的适宜预处理条件、酶种组合和适宜浓度、等渗剂浓度及酶解时间等相关技术条件研究，建立较为完善的栓皮栎原生质体游离技术体系。
（二）项目研究拟解决的关键问题（限300字）
栓皮栎植株组培再生技术
栎树无性繁殖困难，主要采用种子园技术生产良种，难以同时利用对优良个体的加性和非加性效应，本研究通过建立栓皮栎无菌体系和植株再生系统，解决无性繁殖技术关键问题的同时，为进一步开展体胚发生和基因工程育种研究奠定基础。
栓皮栎叶肉及愈伤组织原生质体游离技术
利用原生质体可以进行细胞融合和体细胞杂交，是一种创造远源杂种，获得同源或异源三倍体、四倍体以及双二倍体的新途径。本研究解决栓皮栎原生质体游离关键技术，建立栓皮栎原生质体游离技术体系，为进一步开展原生质体培养，实现细胞工程育种突破奠定基础。
四、项目实施方案
（一）项目研究拟采取的研究方法、技术路线、实验方案（限1000字）
1、研究方案和技术路线
本项目以栓皮栎无菌茎段、叶片、叶柄等为材料，诱导产生愈伤组织，并通过筛选培养基诱导愈伤组织分化为芽和根，构建再生体系；在此基础之上，以无菌苗叶片和愈伤组织为材料，探索原生质体游离条件，形成较为完善的栓皮栎原生质体游离技术体系。
技术路线如下：
愈伤组织继代适宜培养基筛选
愈伤组织继代适宜培养基筛选
愈伤组织分化出芽培养基筛选
生根培养基筛选
栓皮栎植株再生体系建立
栓皮栎茎段外植体
无菌体系
消毒、灭菌、接种
无菌茎段、叶片、叶柄
无菌叶片和愈伤组织
愈伤组织诱导适宜培养基筛选
适宜预处理技术研究
适宜酶种及浓度筛选
适宜等渗剂浓度筛选
适宜酶解时间研究
栓皮栎原生质体游离技术体系
2、研究方法
（1）栓皮栎外植体的接种和继代培养
采集栓皮栎枝条水培，抽条后，切取含腋芽的幼嫩茎段做为外植体，依次经滴露表面消毒5min，自来水冲洗30min，70%酒精浸泡30s，无菌水冲洗3次，0.1%HgCl2浸泡处理2min，无菌水冲洗3次的消毒过程后接入MS(Murashige和skoog，1962）附带6-BA0.2mg/L的初始培养基。接种后每20至30天转接一次，继代培养基为MS附带6-BA0.6mg/L，扩大无菌材料数量。
（2）栓皮栎愈伤组织的诱导
采用正交试验设计，分别以栓皮栎无菌茎段、叶片和叶柄为材料，进行愈伤组织诱导培养基适宜激素种类及配比的筛选，以MS作为基本培养基，筛
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