玫瑰单萜合成酶的酶活动力分析.docx

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摘要：玫瑰（RosarugosaThunb.）是我国传统花卉之一，种植历史已达千年以上。玫瑰精油素有“液体黄金”美誉，已成为目前玫瑰经济利益潜能挖掘的重要对象，但是由于单位产量较低，限制了玫瑰产业的发展。本文以‘丰花玫瑰’为试材，克隆出RrTPS1基因，进行了序列分析，在得到的TPS蛋白的基础上研究其催化单萜合成的酶活性，解析其基础的酶动力学特性，得到的主要结论如下：

将获取的玫瑰单萜合成酶cDNA序列，通过生物信息学分析，TPS1蛋白由580个氨基酸组成，

C2984H4649N791O901S26，66.855Kda，正负电荷残基分别是65和88半衰期为30，平均疏水性为-0.357，为亲水蛋白。

利用得到的玫瑰单萜合成酶蛋白催化底物GPP和NPP,得到萜类产物进行测定，测定结果为催化NPP产生橙花叔醇。

关键词：玫瑰，单萜合成酶，原核表达，酶活测定，基因

1引言

玫瑰是重要的观赏和经济植物，香味是玫瑰最易识别的特征之一，但在目前已知的玫瑰品种中，仅约有20%被归类为“芳香型”，而还有30%则根本不含香气（ChandlerandLu,2005）。以切花和视觉特性为重点的育种会使得玫瑰的气味性状处于不利地位（Lavidetal.,2002）。随着有关生物技术手段的拓展与提高，采用分子及遗传学手段改变植物的香气组成成分及挥发物含量已成为当今研究的热点（罗婧，2018）。萜烯类化合物是植物中（尤其是花卉）香味形成的重要挥发性物质，其成分及含量在不同物种之间存在很大的差异。萜烯合酶（TPS）是作用于萜烯类物质合成过程中最后一步的反应酶，可进一步催化两条萜类合成途径（甲羟戊酸途径（MVA）和甲基赤藓糖醇磷酸途径（MEP））分别的产物（法尼基二磷酸（FPP）和香叶基二磷酸（GPP））生成为萜类物质（Tholl,2006;

Degenhardtetal.,2009）。TPS基因是影响玫瑰主要花香成分生物合成途径的重要因子，不同物种间TPS的种类和功能也极不相同，它们共同决定着物种间萜烯类物质的多样性（Tholletal.,2005）。萜类物质不仅对于玫瑰具有重大生理意义，也对其花香的形成和精油的产量起到决定性作用。因此，研究玫瑰有关萜类化合物合成所需的相关基因，以及梳理其代谢途径的机理和调控网络变得越来越重要。从玫瑰花瓣提取的玫瑰精油带有浓郁、芬芬、柔和的香味，价格昂贵，用途广泛。玫瑰精油中，香茅醇，香叶醇，橙花醇等单萜类挥发性化合物是其主要成分，它们在玫瑰香气中起着重要的作用。而单萜合酶是玫瑰单萜生物合成途径中的最后一步催化酶，是直接决定前体物质产生单萜的关键步骤。在芳香植物中，很多萜类合成酶基因（TPS）被克隆鉴定为花香调控的重要因子，百合、茉莉

和香雪兰等植物中，相继报道了通过蛋白表达鉴定单萜合酶的功能研究，如香雪兰FhTPS4可以催化底物形成沉香醇，百合的五个单萜合酶均可把GPP转化为罗勒烯。迄今为止，相关研究已经发现RrAAT、RrLIS、RrDXR、RrDXS、

RhNUDX1、RrAADC和RrPAR基因与玫瑰的香气密切相关（陈陈，2012；李婷琳，2013；王佳，2016）。综合已有文献可知，TPS在蔷薇属植物中可能存在关键的花香调控基因，通过蛋白体外酶活测定，鉴定其催化活性、识别底物和产生的单萜产物，是深入研究其功能的基础，意义重大。本课题拟通过对前期研究中鉴定的两个TPS酶进行原核表达，分离获得活性TPS蛋白，研究其催化单萜合成的酶活性，解析其基础的酶动力学特性，为后续开展精细功能研究打下基础。

TPS酶功能多样，其底物主要有香叶醇焦磷酸GPP及其顺反异构体，橙花叔醇焦磷酸NPP及其顺反异构体，通过蛋白序列分析难于预测其底物以及酶活，故在分离得到TPS蛋白基础上，进行TPS酶活测定，确定其底物和产物，为后续的TPS功能验证打下良好基础。

玫瑰单萜合酶酶活测定的试验内容

材料与试剂

植物材料

试材为‘丰花玫瑰’，于我校文汇路校区玫瑰田中种植，在盛开期随机采样，将花朵放于零下80摄氏度冰箱中保存备用。

试剂配置

LB液体培养基（300毫升）：在电子天平上称取6克NaCl、6克蛋白胨和3克酵母提取物，加入蒸馏水定容至600毫升，在121摄氏度条件下培育20分钟后，在4摄氏度冰箱存放备用。

Kan抗生素（每毫升50毫克）：称取五十毫克Kan粉末，溶于1毫升双蒸水，过滤灭菌，分装后在负二十摄氏度冰箱中存放备用。

LB固体培养基：在液体培养基配方的基础上加入百分之一点五的琼脂，高温高压灭菌二十分钟，等培养基稍微冷却加入适量Kan抗生素，均匀摇晃后进行分装。

试剂配方表

试剂名称

试剂名称

配方

Acrylamide29g、Bi