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化妆品美白实验（鱼胚实验）实验方法

1.范围

本标准规定了化妆品美白功效的斑马鱼鱼胚实验的实验原理、实验准备、

实验方法和实验结果。

第一法为显微观察法，适用于液态水基类、膏霜乳液、凝胶类、可溶性粉

剂化妆品原料及其产品的美白功效定性观察。

第二法为黑色素生成抑制检测，适用于液态水基类、膏霜乳液、凝胶类、

可溶性粉剂化妆品原料及其产品美白功效定量检测。

第三法为酪氨酸酶活性抑制检测，适用于液态水基类、膏霜乳液、凝胶类、

可溶性粉剂化妆品原料及其产品美白功效定量检测。

2.定义

hourspost-fertilization（hpf）：受精后小时数

3.规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所

有的修改单）适用于本文件。

化妆品安全技术规范2020版

GB/T6678化工产品采样总则

GB/T6679固体化工产品采样通则

第一法显微观察法

4.检测原理

受试样品配置成溶液孵育鱼胚72h后，于体式显微镜下观察，可根据黑色

素在鱼胚体表的沉积，观察到黑色素含量的变化。

5.实验材料与试剂

5.1.材料

5.1.1.斑马鱼交配盒

5.1.2.鱼胚收集器

5.1.3.细胞培养板：6孔细胞培养板

5.2.试剂

5.2.1.二甲基亚砜

5.2.2.二甲基亚砜标准储备液（1%）：量取二甲基亚砜标准品1.0mL（精确至

0.1ml），用斑马鱼系统养殖水稀释并定容至100mL容量瓶，于28℃保存。

5.3.对照品

5.3.1.熊果苷标准品，纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物。

5.3.2.熊果苷标准储备溶液（1mg/mL）：称取熊果苷标准品10mg（精确至

0.01mg），用斑马鱼系统养殖水溶解并定容至10mL容量瓶，于28℃保存。

6.实验仪器与设备

6.1.斑马鱼养殖系统

6.2.连续变倍体式显微镜（带拍照功能）

6.3.恒温培养箱

6.4.天平：精密度0.00001g

6.5.软件：SPSS统计分析软件、Origin函数绘图软件

7.实验步骤

7.1.实验准备

7.1.1.鱼胚品系：野生型AB系斑马鱼自然交配的胚胎；

7.1.2.鱼胚要求：以斑马鱼开始交配受精为0hpf，选用8~10hpf健康、无畸

形、正常发育的鱼胚用于实验；

鱼胚死亡的表现形式：胚胎的凝固，体节形成缺失，尾未分化和心跳缺失，

任何这些观察结果中的一个阳性结果都意味着胚胎的死亡。

鱼胚畸形的表现形式：脊柱弯曲，心胞水肿，尾部弯曲，血管堵塞等。

7.1.3.鱼胚孵育温度：28±1℃;

7.2.样品提取

7.2.1.水溶性样品：使用斑马鱼系统养殖水将受试样品稀释成0.01、0.1、1、

10、100mg/mL实验浓度，混匀，于4℃保存备用。

7.2.2.非水溶性样品：使用二甲基亚砜标准储备液（1%）将受试样品稀释成

0.01、0.1、1、10、100mg/mL实验浓度，混匀，于4℃保存备用。

7.3.对照组溶液

7.3.1.空白对照组溶液：斑马鱼系统养殖水

7.3.2.溶剂对照组溶液：二甲基亚砜标准储备液（1%）

7.3.3.阳性对照组溶液：熊果苷标准储备溶液（1mg/mL）

7.4.实验方法

随机挑选8~9hpf健康、无畸形、正常发育的鱼胚用于实验。使用6孔细胞培养板为实验载体，每组设置3个平行组，每孔加入鱼胚20枚，受试样品组加入受试样品溶液5mL，空白对照组加入斑马鱼系统养殖水5mL，溶剂对照组加入二甲基亚砜溶液（1%）5mL，阳性对照组加入熊果苷标准储备溶液

（1mg/mL）5mL，置于恒温培养箱28℃孵育。

8.实验结果

于24、48和72h时在体式显微镜下观察,并拍照记录。其中，每组实验取3尾鱼胚用于拍照，拍照时固定拍照参数，将鱼胚平躺固定，聚焦鱼胚卵黄囊部位进行拍照，拍照时固定拍照参数，将鱼胚平躺固定，聚焦鱼胚卵黄囊部位

进行拍照，观察各组斑马鱼体表黑色素的分布面积和数量。

9.质量控制

9.1.1.基本原则：测试中设置的对照检测应符合以下情况，如出现非下述标准，

则视为质控不合格。

9.1.2.根据观察结果，与空白组和阳性对照组相比，可明显观察到体表黑色素

的分布面积和数量减少，说明受试样品有效。

第二法黑色素生成抑制检测法

10.检测原理

受试样品配置成溶液孵育鱼胚72h后，通过对鱼胚破碎、离心，