生物化学及分子生物学实验考试 .pdfVIP

一、实验原理步骤：

1、分子克隆总流程：

分子克隆：在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，

用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引

入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载

体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。

流程：

（1）带有目的基因的DNA片段的获得——PCR引物设计，PCR获得。

（2）重组DNA分子的构建——与载体酶切连接。

（3）重组DNA分子的转化和重组克隆的筛选——转化，培养，筛选

（4）检测——菌落PCR检测，粗提质粒检测，酶切检测，精提质粒，测序。

2、质粒DNA的提取及鉴定——碱裂解法

原理：

根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。

•在pH12.0-12.5，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，

质粒DNA的氢键断裂，但两条互补链仍紧密结合。

•当加入pH4.8的KAc高盐缓冲液中和pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA

复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性慢，缠

绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与RNA、蛋白质-SDS复合物等一起絮状沉

淀下来而被除去。

步骤：1、细菌培养和收集

①将3ml含Kan的LB液体培养基加入到试管中，接入含质粒的大肠杆菌，

37℃振荡培养过夜。（已完成）

②取2.5mL培养物倒入微量离心管（EP管）中,10000rpm离心1min，吸去

培养液。

2、细菌裂解及质粒的提取

③将细胞沉淀悬浮于100ul溶液I中,充分震荡混匀。

④加200ul溶液II(新鲜配制),盖紧管盖,轻轻混匀内容物,将离心管放冰上

5min。

⑤加150ul溶液III(冰上预冷),盖紧管口,轻轻颠倒数次使混匀。冰上放置

10min。

⑥12000rpm离心10min,将上清转至另一EP管（作好标记）中。

3、质粒的纯化

⑦向上清中加入等体积（450ul）酚:氯仿(1:1)（注意下层是有机相）,反复

混匀。

⑧12000rpm,离心2分钟,将上清小心地转移到另一离心管（标记！）中

⑨加入等体积（450ul）氯仿:异戊醇(24:1),反复混匀。

⑩12000rpm,离心2分钟，取上清液于新的EP管中。

4、质粒的浓缩

①加入2倍体积（900ul）无水乙醇,混匀后,室温放置10-15min。

②12000rpm离心5分钟，倒去上清液,把离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体。

③用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀,振荡并离心,12000rpm离心2分钟，倒去上清

液,空气中干燥5－10min。

5、质粒的溶解和保存及电泳检测

④加20ulTE缓冲液,其中含有100ug/ml的胰RNA酶,使DNA完全溶解。

⑤-20℃保存

⑥1%胶，恒压150V,电泳10-20分钟

要点：载体定义：基因工程中携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。

类型：大肠杆菌中的质粒、噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体及

动、植物病毒载体等。

条件：复制子、咸志梅单一识别位点、标记基因、适合的拷贝数

•碱解法、煮沸法（cDNA、pDNA变性、复性不同）

•苯酚抽提法（酸性、低离子强度时超螺旋在水相分布）

•CsCl法（EB插入造成DNA浮力密度不同）

•SDS裂解法（高盐浓度