基因工程第四章载体.pptVIP

vectors;在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。;（1）在宿主细胞内能独立复制。

（2）有选择性标记。;基因工程中常用的载体有5类：;第一节质粒载体;（1）分子小：;;③线形DNA（linear，lDNA）;除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。;虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。;带有控制大肠杆菌素（colicin）合成的基因。;三、质粒的复制类型;（1）分子量大，拷贝数低;ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicinE1）。;（1）具有复制起点（ORI）;;氨苄青霉素抗性（Ampr）

卡那霉素抗性（Kanr）

四环素抗性（Tetr）

链霉素抗性（Strr）

氯霉素抗性（Cmlr）;常用抗菌素的抗性工作原理;通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。;a）杀菌原理;a）杀菌原理;b）细菌抗性原理;;当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。;（1）高拷贝数的质粒载体;但有特殊用途:;这是一类温度敏感型复制控制质粒。;载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。;如pUR2、pTR262等。;主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。;复制起始点ORI、

选择标记、

多克隆位点MCS;1.pSC101;7个克隆位点：

EcoRI、XhoI、PvuI、HindIII、BamHI、SalI、SmaI。主要使用EcoRI。

;（1）类型;①colicinE1基因的结构;EcoRI位于E1内部，插入外源DNA会导致E1失活，使受体菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表现出对E1免疫型（ImmE1+）。;;pSP2124质粒的Ampr基因;;①双抗菌素抗性选择标记;外源基因?PstI;氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copy;保留了转移蛋白（mob）的作用位点。;①删除mob识别位点;pBR325：;UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1987年，在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体。;①复制起点;（2）长度;（4）选择标记;①更小的分子量：;;①如果加入纯化的T7或SP6RNA聚合酶，在试管里就可以转录mRNA;（1）穿梭质粒载体的结构;;②也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。;1.质粒稳定遗传必须的两个条件：;有主动分配和随机分配两种假说。;人工构建的质粒载体缺失了par区，只能以随机分配方式分到子细胞中。;在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。;（structuralinstability）;（1）新陈代谢负荷：;每个菌体中所拥有的质粒拷贝数不完全相同，称差度。;野生型E.coli中，质粒在寄主的重组酶作用下会发生重组形成二聚体质粒。;噬菌体是一类细菌病毒（Bacteriophage）。;;分为两种：;感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中。形成这一过程称为溶源化（lysogenization)。;;;（2）复制型（RF）是双链环状DNA。;RFdsDNA在寄主细胞内以高拷贝形式存在。;虽然不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生长变慢，约为正常的1/2—3/4）;+DNA;M13的包装过程：;M13基因组中只有基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区。;在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ’（?-肽序列)。

利用?-肽序列中的三个单一酶切位点（BglII、AvaII和PvuI）。;M13RF;Ampicillin抗性和lacZ的?肽互补（蓝白斑）相结合。;?-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。;1）?-肽（lacZ’）：;2）受体菌lacZ突变（lacZ?M15）;pUC质粒(M13)载体上的lacZ’编码?肽与这个缺失突变的?-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体。又能分解Xgal。产生蓝色物质。;pUC(M13)载体上LacZ’的5‘端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ’的合成。不能互补。;IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ的C端部分和载体的lacZ’?肽都表达。从而互补。;通过看培