58-0928-实验结果-流式细胞术检测细胞凋亡和细胞内ROS（3）.doc

流式细胞术检测细胞凋亡和细胞内ROS（3）

【实验结果】

1.细胞凋亡实验结果：

AnnexingⅤ-FITC/PI双染色的细胞在流式细胞仪上分为4个区域。其中Q1区为机械性损伤的细胞碎片，Q2区为中晚期凋亡细胞和坏死细胞，Q3区为活细胞，Q4区为早期凋亡细胞，Q2+Q4所占百分比为细胞的总凋亡率。如图1表1所示。与正常对照组5%±2%的总凋亡率相比，模型组的总凋亡率为43%±5%，差异显著，P0.01；麦冬多糖从25μg/mL到200μg/mL干预组其细胞的总凋亡率分别为25±5%，24±2%，25±6%，26±4%，与模型组相比差异显著P0.01；各药物组之间无明显的差别P0.05。

表1流式细胞术检测HUVEC细胞凋亡（，n=3）

组别

细胞总凋亡率（Q2+Q4）

对照组

5±2%

模型组

43±5%##

OJP1-25组

25±5%**

OJP1-50组

24±2%**

OJP1-100组

25±6%**

OJP1-200组

26±4%**

##：与正常组比较P0.01；**：与模型组比较P0.01OJP1-25，麦冬多糖25mg/kg组；OJP1-50，麦冬多糖50mg/kg组；OJP1-100，麦冬多糖100mg/kg组；OJP1-200，麦冬多糖200mg/kg组。

图1流式细胞术检测HUVEC细胞凋亡

2．细胞内ROS检测结果：

如图2所示。与正常对照组相比，模型组细胞经H2O2损伤后，细胞ROS含量显著增加（P0.01）；与模型组相比，不同浓度的麦冬多糖干预后ROS的含量均显著降低（P0.05，P0.01）。从图可见，麦冬多糖浓度从200μg/mL降低到50μg/mL，ROS的含量逐渐减少。麦冬多糖浓度减低到25μg/mL时期ROS的含量又稍微增高。

注：##：与正常组比较P0.01；*：与模型组比较P0.05；**：与模型组比较P0.01。OJP1-25：麦冬多糖25μg/mL组；OJP1-50：麦冬多糖50μg/mL组；OJP1-100：麦冬多糖100μg/mL组；OJP1-200：麦冬多糖200μg/mL组。

图2麦冬多糖对H2O2损伤HUVEC细胞ROS的影响（，n=6）

【结果讨论】

H2O2可诱导细胞的氧化损伤，而氧化反应可以参与内皮细胞病理变化的各个环节,在血管性疾病的病理过程中起非常重要的作用。氧化损伤的早期，表现为多种特征的细胞凋亡。有研究报道H2O2诱导细胞凋亡，当内皮细胞处于低浓度的H2O2时，细胞表现为凋亡，且有时间与浓度依赖性。而处于高浓度的H2O2时，细胞则表现为死亡。从本研究的流式凋亡图中，可以看出H2O2损伤HUVEC细胞4h后，Q2+Q4细胞所占的百分比（细胞凋亡率）比正常对照组显著增加，提示H2O2诱导细胞后对细胞氧化损伤严重，引起细胞发生凋亡的改变，与前人研究结果相符。而麦冬多糖药物组处理细胞后，凋亡率明显降低，说明麦冬多糖能缓解H2O2对细胞的氧化损伤。

线粒体是为细胞供能的主要场所，同时也是活性氧产生的主要场所。活性氧(ReactiveoxygenspeciesROS)是在发生氧化还原反应时产生的一类化学性质的物质总称。一定量的ROS，是细胞内的信号传导分子，在维持细胞正常的生理过程中是必需的。但是在氧化损伤的早期，活性氧的生成过多，引起脂质过氧化、损伤蛋白、DNA等。本实验采用荧光探针DCFH-DA检测ROS。DCFH-DA本身没有荧光,可以自由穿过细胞膜,进入细胞内后,可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内ROS的水平。从本实验结果可见。H2O2诱导HUVEC细胞损伤后，ROS的生成量是正常对照组的1.4倍，表明H2O2促使细胞产生过量的ROS，引起细胞过氧化损伤。而随着麦冬多糖浓度的降低，细胞内ROS的生成量也逐渐减少，说明麦冬多糖能对抗细胞ROS的过量产生，且低剂量的效果优于高剂量。