规模化肉牛场牛轮状病毒病诊断与防治技术规程.docxVIP

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规模化肉牛场牛轮状病毒病诊断与防治技术规程

1范围

本文件规定了规模化肉牛场牛轮状病毒病诊断与防治技术的术语和定义、诊断、预防和治疗。

本文件适用于规模肉牛场牛轮状病毒病的防治。其他肉牛场参照执行。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）

适用于本文件。

GB/T16568奶牛场卫生规范

NY/T5049无公害食品奶牛饲养管理准则

NY5047无公害食品奶牛饲养兽医防疫准则

NY5030无公害农产品兽药使用准则

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1牛轮状病毒病Bovinerotavirus

是指由牛轮状病毒引发犊牛精神沉郁、厌食、呕吐、腹泻、脱水为主要特征的急性胃肠道传染

病。

4诊断

4.1流行病学

牛轮状病毒多发于7日龄以内的犊牛。病牛和带毒牛是感染性腹泻的主要传染源。通过消化道、呼吸道、接触、胎盘和交配等途径传播。本病一年四季均可发生，尤以气候多变、寒冷季节和环境

卫生较差时多发。

4.2临床症状

犊牛感染后12h～24h出现严重腹泻，发病突然，病初表现为精神不振、厌食和腹泻，体温正常或略高，排黄白色稀便，有时带有黏液和血液。病程长者脱水明显，严重者常有死亡。成年牛

多呈隐性感染，并在一定时间持续向外界排毒。

4.3病理变化

牛轮状病毒感染病理变化主要表现在消化肠道，肠腔内充满凝乳块和乳汁，小肠肠壁变薄、半

透明，肠内容物呈液状、灰黄或灰黑色。

4.4结果判断

出现4.1、4.2、4.3，可判定为牛轮状病毒病疑似病例。

5实验室诊断

5.1主要仪器设备

电镜、低温高速离心机、倒置显微镜、CO2细胞培养箱、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪。

5.2主要试剂

PBS、2%磷钨酸、胰酶、MA104细胞、PCRTaq酶。

5.3样品采集

5.3.1粪便样品

将棉拭子伸入肛门内刮取新鲜粪便，放入装有3mLPBS采样管中；也可无菌采集地上刚排出

新鲜粪便。编号并记录相关信息。

5.3.2组织样品

取病死牛肠道及内容物、肝、脾、淋巴结等，置于无菌密封袋或采样杯内。

5.4样品处理

对于粪便样品，放入盛有3mLPBS管中，充分振荡，12000r/min4℃离心5min～8min，取上清备用；对于组织样品，称取1g置于研钵，充分研磨后加5mLPBS，混匀，8000r/min4℃离心5min，取上清备用。将上清于0.22μm滤器过滤，-80℃冰箱保存或直接接种细胞。

5.5病原检测

5.5.1病原检测

5.5.1.1电镜检查

将采集的粪便或肠内容物用PBS制成1:4悬液，于盛有玻璃珠的管内充分震荡30min，取悬液3000r/min离心30min，取上清，15000r/min离心30min，取上清，以40000r/min～50000r/min离心3h～5h，弃上清，加1～2滴蒸馏水悬浮管内沉淀，滴加铜网，2%磷钨酸染色，电镜下观察病

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毒粒子形态。

5.5.1.2病毒分离鉴定

将处理的样品接种MA104细胞进行病毒分离培养，根据中和试验（固定血清-稀释病毒法）进

行病毒鉴定。

5.6分子检测

5.5.1基因组RNA提取

将5.4中样品上清或5.5.1.2中纯培养细胞毒用商品化试剂盒进行基因组RNA提取。提取方法

按试剂盒说明书进行。

5.5.2反转录

将5.5.2中的基因组RNA利用反转录试剂进行反转录（见附录表A,B）。

5.5.3基础RPA鉴定

应用基础RPA方法进行病原核酸检测，BRV引物序列（见附录表C）。

每次进行RPA扩增时，除检测样品外，均需设置阳性对照和阴性对照。

RPA反应体系（见附录表D），反应条件为37℃25min。

5.5.4RPA产物电泳

用1×TAE电泳缓冲液配制成2%琼脂糖凝胶。取5μL产物分别加入样品孔，同时在一加样孔中加入DNA分子量标准（DL500），以5V/cm恒压电泳，30min后采用凝胶成像系统判定核酸片

段大小。

5.5.5RPA结果判定

5.5.5.1阳性对照出现一条199bp大小的条带，且阴性对照不出现条带。

5.5.5.2