2025年高考生物人教版配套课件 新高考新教材 专题精研课13　PCR技术中引物的拓展应用.pdfVIP

2025年高考生物人教版配套课件新高考新教材

专题精研课13PCR技术中引物的拓展应用

应用1:(实时)荧光定量PCR(RT-PCR)——以“新冠病毒核酸检测”为例

(1)RT-PCR

RT-PCR是将RNA的逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式反应(PCR)相结合的

技术。首先经逆转录酶的作用,由RNA合成cDNA,再以cDNA为模板,在

DNA聚合酶的作用下扩增合成目的片段。

(2)实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的

积累,实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析

的方法。

先从样本中提取RNA,RNA中可能有新冠病毒的RNA,同时也存在很多采

样患者的组织和存在于采样部位的微生物的RNA。通过逆转录酶将样本

的RNA逆转录为cDNA,并进行PCR扩增,在PCR反应体系中,包含一对特异

性引物以及一个Taqman探针,该探针为一段特异性寡核苷酸序列,两端分

别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧

光信号被淬灭基团吸收;若反应体系存在靶序列,PCR反应时探针与模板结

合,DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解,报告基团与淬灭

基团分离,发出荧光。每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子产生。荧光

定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸

浓度有关,病毒核酸浓度越高,Ct值越小(如图)。

(3)实时荧光定量PCR方法检测新冠病毒核酸

从样本中提取病毒RNA,经逆转录酶作用形成cDNA。然后以cDNA为模板

进行实时荧光定量PCR扩增,测定样品中病毒核酸量。

在通过实时荧光定量PCR检测新冠病毒感染时,检测到的荧光强度变化如

图所示。与指数增长期相比,线性增长期目的基因数量的增长率下降,可能

原因有底物浓度下降、酶活性下降等。Ct值的含义是指在PCR扩增过程

中,每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。

当样本中初始模板越多时,Ct值就越小。Ct值≤37判定为阳性,Ct值40或

无Ct值判定为阴性。上图所示新冠病毒核酸检测结果应判定为阳性。

应用2:PCR定点突变技术

该技术要使用四条引物。其中引物

2和3的突起处代表与模板链不能互

补的突变位点,而这两条引物有部

分碱基(包括突变位点)是可以互补

的。因此,分别利用引物1和2,引物3

和4进行PCR后,得到的DNA片段可

以通过引物2和3互补的碱基杂交在

一起,再在DNA聚合酶的作用下延

伸,就能成为一条完整的DNA片段。

最后,用引物1和4进行扩增得到含

有突变位点的DNA片段。通过测序

可以检验定点突变是否成功。

专项突破

1.(2023·江苏扬州质检)实时荧光RT-PCR可用于RNA病毒的核酸检测,其

原理是:在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合,探针两侧分别带有

荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团,新链延伸过程中,DNA聚合酶会破

坏探针,导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT-PCR进行核酸

检测的相关过程如图所示。

下列说法错误的是()

C

A.做RT-PCR之前,需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针

B.RNA不能作为PCR扩增的模板,故需要将样本中的RNA逆转录为DNA后

再进行扩增

C.若检测结果有强烈荧光信号发出,说明被检测者没有感染病毒

D.病毒的检测还可以检测病毒表面的物质或病毒引发产生的抗体,其原理

都是抗原—抗体杂交

解析PCR扩增必须以DNA为模板,RNA不能作为PCR扩增的模板,所以需

要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增,B项正确;若检测结果有强

烈荧光信号发出,说明被检测者极有可能感染了病毒,C项错误。

2.(2023·山东烟台联考)荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含

量。其原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某模板链

互补的荧光探针,荧光探针两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬

灭基团,探针完整时,发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收,荧光监测

系统接收不到荧光信号。当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处,

会水解探针,使荧光监测系统接收到荧光信号。即每扩增一次,就有一个荧

光分子生成(如图所示)。

下列相关叙述正确的是()

C

A.扩增过程中引物先于探针结合到模板DNA上

B