生物技术常用技术技术及应用.ppt

Ct值的确定第96页,共108页，星期六，2024年，5月（3）Ct值与起始模板的关系理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率第97页,共108页，星期六，2024年，5月在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)XCt：荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。在阈值线设定以后，它是一个常数，设为M。方程式(1)两边同时取对数得:logM=logX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:logX0=-log(1+Ex)*Ct+logM(3)Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值，就可计算出样品中所含的模板量。第98页,共108页，星期六，2024年，5月模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量第99页,共108页，星期六，2024年，5月确定未知样品的C(t)值通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量Sample25第100页,共108页，星期六，2024年，5月（4）荧光标记方法????可分为两种：—荧光探针（Taqman）—荧光染料（SYBRGreen）第101页,共108页，星期六，2024年，5月第102页,共108页，星期六，2024年，5月第103页,共108页，星期六，2024年，5月?分子生物学研究领域克隆重组突变体构建突变分析SNP序列分析七、PCR技术的应用第104页,共108页，星期六，2024年，5月PCR技术的应用食品安全检测致病性微生物（细菌、病毒、真菌）的检测寄生虫检测转基因食品检测食品掺假成分的检测食品生物技术第105页,共108页，星期六，2024年，5月PCR技术的应用?医学研究基因表达水平与疾病的相关性基因变异与疾病的相关性基因与表型的关联基因之间的相互关系寻找未知基因研究基因功能第106页,共108页，星期六，2024年，5月PCR技术的应用?临床医学遗传学（各种遗传病）肿瘤学（K-ras、p53、微卫星、端粒酶、p16、BCR/ABL等）传染病学（病毒、细菌、寄生虫等）其他第107页,共108页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第108页,共108页，星期六，2024年，5月

⑤Southern印迹杂交(Southernblot)

第64页,共108页，星期六，2024年，5月

6.PCR-ELISA引物双标记：生物素/地高辛、荧光素引物5’端标记生物素+RNA探针标记地高辛将一寡核酸探针固定于微孔板作为捕获探针，变性的PCR产物单链的某一区域与之杂交后，此单链间接地固定于微孔板上。再用一非放射性标记物标记（如生物素）的检测探针与固定于微孔板的PCR产物单链的另一区域杂交。第65页,共108页，星期六，2024年，5月7.PCR产物测序方法：双脱氧核苷酸链末端终止法化学裂解法用途：目前一般多用于科研第66页,共108页，星期六，2024年，5月五、PCR常见问题无扩增产物非特异性扩增拖尾假阳性第67页,共108页，星期六，2024年，5月PCR常见问题之一无扩增产物模板:含有抑制物，含量低Buffer对样品不合适引物设计不当或者发生降解反应条件：退火温度太高，延伸时间太短原因对策纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量更换Buffer或调整浓度重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物降低退火温度、延长延伸时间现象：正对照(marker?)有条带，而样品则无；第68页,共108页，星期六，2024年，5月PCR常见问题之二非特异性扩增现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。第69页,共108页，星期六，2024年，5月PCR常见问题之二引物特异性差模板或引物浓度过高酶量