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禽源沙门氏菌快速检测技术

1范围

本标准规定了禽源沙门氏菌鉴别培养和PCR检测技术以及种鸡场主要流行沙门氏菌（B群和D群沙门氏菌属）血清学ELISA检测技术。

本标准适用于各种禽类携带沙门氏菌的检疫、诊断、监测和流行病学调查，也可用于规模化种鸡场中沙门氏菌病的净化。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.4—2016食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求

GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫

NY/T541—2016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3试剂和材料

3.1除另有规定外，所用化学试剂均为分析纯。实验所用水均符合GB/T6682二级水的规定，实验中人员配置、实验室管理、仪器设备使用、样品实验试剂和废弃物处理等均符合GB/T27401的规定。

3.2LB液体培养基（见附录A.1）。

3.3BPW前增菌液（见附录A.2）。

3.4SC增菌液（见附录A.3）。

3.5TTB增菌液（见附录A.4）。

3.6XLD鉴别培养基（见附录A.5）。

3.7电泳缓冲液（见附录A.6）。

3.8阳性对照选择鸡白痢沙门氏菌（CVCC535）、肠炎沙门氏菌（CVCC3377）作为阳性对照。3.9阴性对照选择不含DNA模板的灭菌超纯水。

3.10沙门氏菌（B群和D群沙门氏菌属）ELISA检测试剂盒。

4仪器设备

4.14℃普通冰箱（温控范围2℃~8℃)。

4.2生化培养箱（温度范围：5℃~50℃,温度均匀度：≤±1℃)。

4.3二级生物安全柜。

4.4PCR仪。

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4.5电泳仪（电压90V～120V）。

4.6控温摇床（温度范围：5℃~50℃)。

4.7凝胶成像仪。

4.8高压灭菌锅（灭菌温度：105℃~135℃;工作压力：≤0.35MPa）。

4.9振荡器。

4.10电子天平（感量0.001）。

4.11单道微量移液器（2μL、20μL、200μL、1000μL）。

4.128或12道微量移液器（10μL）与配套吸头。

4.13酶标仪。

5样品采集、储存及运输

5.1按NY/T541—2016规定进行采样。无菌操作采集疑似沙门氏菌感染禽类的粪便、脏器（匀浆）或肛拭子等，编号。

5.2样品采集和样品处理应戴一次性手套，不得交叉污染。

5.3采集的样品储存和运输，按照NY/T541—2016规定进行。

6鉴别培养和PCR检测方法

本实验具体实验操作符合GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求，样品增菌培养方案按照GB4789.4—2016执行。

6.1鉴别培养

6.1.1按体积1:9比例，取粪便、脏器0.5g或肛拭子等加入到4.5mL的BPW前增菌液试管中，置于37℃摇床中，220rpm培养10h～12h。

6.1.2取培养后的前增菌液500μL分别加入到4.5mLSC和TTB增菌液中，置于37℃摇床中，220rpm培养18h～24h。

6.1.3接种针蘸取培养后的SC和TTB增菌液，以“之”字形划线于XLD鉴别培养基平板，置于37℃培养箱中，培养24h～48h。

6.1.4鸡白痢沙门氏菌形成的菌落呈无色半透明状，其它沙门氏菌在XLD鉴别培养基平板上的形态一般为黑芯菌落（参见附录B）。

6.1.5每个样品挑取3～5个疑似菌落，分别加入500μL～1000μLLB液体培养基，37℃摇床中，220rpm培养6h～8h。

6.2PCR的检测方法

6.2.1引物

参照参考文献（张江英等，2013），合成基于沙门氏菌fimW基因的一对引物作为沙门氏菌鉴定的通用引物，引物序列参见附录C。

6.2.2PCR扩增

PCR反应总体积为25μL，引物为F1/R1，模板分别为6.1.5中培养的菌液，PCR反应体系参见附录C。

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PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃45s、50℃45s、72℃60s，循环扩增35次，最后72℃延伸7min，4℃保存。