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(二)AKP比活性测定1、样品酶活性测定:酶活性单位计算:在37℃下保温15分钟产生1毫克酚,称为该酶的1个活性单位(U)。计算每毫升酶液的酶活性单位(U/mL)2、样品酶蛋白含量测定:计算每毫升酶液的蛋白含量(mg/ml)3、比活性计算:比活性(U/mg)=每毫升酶液的酶活性单位/每毫升酶液的蛋白含量4、注意事项:注意各阶段的稀释倍数及取样量。各管加样量要准确,注意反应时间。第31页,共52页,星期六,2024年,5月实验七碱性磷酸酶酶促反应动力学实验第32页,共52页,星期六,2024年,5月实验要求了解酶促反应动力学的研究内容及意义通过检测不同温度条件下AKP的活性,了解温度对酶活性的影响学习测定酶最适pH的方法,了解pH对酶活性的影响了解底物浓度对酶促反应速度的影响,学习测定米氏常数(Km)的原理和方法。第33页,共52页,星期六,2024年,5月实验原理酶促反应动力学是研究酶促反应速度以及影响此速度的各种因素的科学,如底物浓度、酶浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等,进行酶促反应动力学研究具有重要的理论和实践意义。酶的催化作用受温度的影响。当温度达到某一定值时,酶促反应达到最高峰,此温度称为酶的最适温度。第34页,共52页,星期六,2024年,5月酶的活力受环境pH的影响极为显著。通常只有在一定的pH范围内,酶才表现其催化活性,且在某一pH时,酶的活性才达最大值,称为最适pH值,不同酶的最适pH值不同。在温度、pH及酶浓度恒定的条件下,底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。一般情况下,当底物浓度很低时,酶促反应速度(V)随底物浓度([S])的增加而迅速增加;但当底物浓度继续增加时,反应速度的增加率就比较小;当底物浓度增加至某种程度时,反应速度达到一个极限值(Vm)。Km值是酶的一个特征常数,是反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。Km可以近似表示酶与底物的亲和力,测定Km是酶学研究的一个重要方法。第35页,共52页,星期六,2024年,5月实验内容1、温度对酶活性的影响2、pH对酶活性的影响3、底物浓度对酶活性的影响(Km的测定)第36页,共52页,星期六,2024年,5月实验结果1、比较各种温度对AKP酶活性的影响,确定其最适温度。2、比较各种pH对AKP酶活性的影响,确定其最适pH值。3、以酶活性单位代表各管中酶反应速度(v)作纵坐标,以底物浓度([s])为横坐标,连接各点,观察该图形的形状。以酶活性单位的倒数(1/v)为纵坐标,底物浓度的倒数(1/[s])为横坐标,在坐标纸描出各点并连接,求该酶的Km值。第37页,共52页,星期六,2024年,5月实验八胰岛素和肾上腺素对血糖浓度的影响第38页,共52页,星期六,2024年,5月实验要求了解胰岛素及肾上腺素调节机体血糖浓度的机理与效果学会制备无蛋白血滤液掌握磷钼酸比色法测定血糖的原理和方法第39页,共52页,星期六,2024年,5月实验原理人和动物体内,血糖浓度受各种激素调节而维持恒定。胰岛素促进肝脏和肌肉将葡萄糖合成糖原,又加强糖的氧化作用,故可以降低血糖;肾上腺素促进肝糖原分解而增高血糖。葡萄糖的醛基具有还原性,与碱性铜试剂混合加热后,被氧化成羧基,而碱性铜试剂中的二价铜则被还原成砖红色的氧化亚铜沉淀,氧化亚铜又可使磷钼酸还原生成钼蓝,使溶液呈蓝色,其蓝色深浅与葡萄糖的浓度成正比。第40页,共52页,星期六,2024年,5月实验内容与结果1、激素的作用:动物准备→取空腹血→注射激素后取血2、血糖的测定:无蛋白血滤液的制备测定血糖计算:样品的血糖含量(毫克%)注意事项:血糖测定反应在取血后2小时内完成,放置过久,糖易分解,使含量减低。磷钼酸试剂宜贮于棕色瓶中,如出现蓝色,表明试剂本身已被还原,不能用。碱性铜试剂中有氧化亚铜沉淀,也不能用。第41页,共52页,星期六,2024年,5月实验九肝细胞DNA的制备及含量测定第42页,共52页,星期六,2024年,5月实验要求学习和掌握浓盐法从肝细胞中提取DNA的原理操作技术学习紫外分光光度计测定DNA含量的原理和操作方法熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法学习定糖法(二苯胺法)测定DNA含量的原理和操作技术第43页,共52页,星期六,2024年,5月实验原理DNA的制备:DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的。动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白(DNP)可溶于水或浓盐溶液(如1摩尔/升氯化钠),但在0.14M盐溶液中溶解度很低,而核糖核蛋白(RNP)则溶于稀盐溶液,利用这一性质
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