外源基因的原核表达.ppt

**扩大培养的条件优化工艺的优化反应器的优化**生物学因素的优化01溶氧量02pH值03温度04培养基成分05培养基的混合情况**四、高效表达目标基因的战略和技术高密度发酵和工程化宿主细胞大肠杆菌高密度发酵是大规模制备重组蛋白质过程中不可缺少的工艺步骤。其目的是在单个菌体对目标基因的表达水平基本不变的前提下，通过单位体积的菌体数量的成倍增加来实现总表达量的提高。目前常用的发酵方式有：恒定培养、流加补料培养、连续培养三种**构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌高密度发酵后期由于菌体的生长密度较高，培养基中的溶氧饱和度往往比较低，氧气的不足导致菌体生长速率降低和乙酸的累积，乙酸的存在对目标基因的高效表达有明显的阻抑作用。这是高密度发酵工艺研究中最迫切需要解决的问题。虽然在发酵过程中可采取通氧气，提高搅拌速度，控制补料速度等措施来控制溶氧饱和度，减少乙酸的产生。但从实际应用上看，这些措施都有一定的滞后效应，难以做到比较精确的控制。因此构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌，是从恨本上解决问题的途径之一。**芽孢杆菌表达系统芽孢杆菌是对人畜无害的革兰氏阳性土壤微生物。细菌细胞壁内不含内毒素，能分泌大量蛋白到胞外，目前已成为一些重要工业酶制剂的生产菌种。**多为非致病性微生物培养条件简单，生长迅速表达产物能分泌到细胞外的培养基中，且多数表达产物具有天然构象和生物学活性遗传背景比较清楚，便于进行遗传操作培养发酵技术比较成熟**01添加标题芽孢杆菌表达系统的不足添加标题芽孢杆菌分泌的蛋白酶量大、种类多，对外源基因表达产物的稳定性形成很大威胁0203添加标题载体不稳定，易造成外源基因的丢失**芽孢杆菌表达载体复制子：目前广泛应用于芽孢杆菌表达载体的复制子有：来源于金色葡萄球菌的复制子如pUB110、pC194和pE194等质粒表达载体。来源于小芽孢杆菌的复制子如pHY481、pWT481等。**芽孢杆菌表达载体启动子：在利用芽孢杆菌表达体系时，必需使用芽孢杆菌能够识别的启动子。芽孢杆菌含有多种转录起始识别因子(σ)，在芽孢杆菌中已鉴定的σ已达十种。启动子可被特异的σ因子识别。芽孢杆菌启动表达具有明显的时序性，与菌体的生长周期和生理代谢活动密切相关。**表达载体：自主复制质粒芽孢杆菌的自主复制质粒大多为无抗性标志的隐蔽质粒。带有抗性标志的自主复制质粒主要来自其它革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌如pUB110、pC194和pE194，并在这些质粒的基础上构建了双标记质粒等载体。自主复制质粒不稳定，在复制过程中易发生丢失。**整合质粒：在大肠杆菌质粒的基础上增加一个芽孢杆菌的抗性标志，以及待整合的目的基因。因其没有芽孢杆菌的复制子，不能自主复制，整合到芽孢杆菌染色体后，随细胞复制而复制。噬菌体：Φ105、SPβ及其它噬菌体均可作为芽孢杆菌的表达载体。其中Φ105是一种温和噬菌体。**宿主菌：野生型芽孢杆菌能分泌大量的胞外蛋白酶，影响外源基因表达产物的稳定性，因此在构建芽孢杆菌表达系统宿主菌时要将蛋白酶基因进行突变，使其灭活或将活性降低。目前应用较多的宿主菌主要有枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等。**枯草芽孢杆菌能分泌6种不同的胞外蛋白酶，即枯草杆菌蛋白酶、胞外蛋白酶、金属蛋白酶、杆菌肽酶及中性蛋白酶A和B。对其中3～5种胞外蛋白酶基因进行突变，可将胞外蛋白酶的活性降低至原来的1％；若将6种胞外蛋白酶基因全部突变，则胞外蛋白酶活性可降至原来的0.3%左右。**短小芽孢杆菌表达体系的优点：短小芽孢杆菌分泌胞外蛋白酶的同时还能产生蛋白酶抑制剂，不同短小芽孢杆菌分泌抑制剂的能力不同，使胞外蛋白酶的活性差异很大胞外蛋白酶活性较低能对许多蛋白质进行分泌表达**细胞壁的结构由三层组成，最外两层为蛋白层，内层为肽聚糖。细胞壁的结构与细胞的生长周期有关。在生长稳定前期，细胞壁的外层和中层蛋白开始从细胞表面脱落，分泌型蛋白开始表达；进入稳定期后，细胞壁的蛋白层全部脱落，细胞壁蛋白仍然表达导致细胞壁蛋白在培养基中大量累积。**利用细胞壁蛋白基因的启动区、操纵区、翻译起始区和蛋白质信号肽序列等元件表达外源基因，可使外源基因在小芽孢杆菌表达系统中获得高效分泌表达。**芽孢杆菌中高效表达的策略提高表达质粒在细胞中的稳定性：以金黄色葡萄球菌为基础构建的一系列质粒在进行滚环复制时会产生许多单链DNA，这些单链DNA的存在会对质粒DNA造成影响，在没有选择压力的情况下易发生丢失；某些表达质粒载体还含有染色体DNA同源序列，在细胞分裂的过程中可发生同源交换，导致质粒的消失。**添加标题构建新型的