实验亲和层析纯化IgG.ppt

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2025-01-17 发布于上海
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**如果不考虑费用，纯化多抗最好的方法顺序如下

抗原亲和（买填料偶联抗原）纯化proteinAproteinG硫酸铵沉淀辛酸法

目前用蛋白多肽作为抗原进行免疫（immunity）得到的多抗绝大多数都采用

抗原亲和（买填料偶联抗原）纯化，这个是最好的选择，只有这个方法才能得到高特异性的多克隆抗体，避免其他杂IgG引起的背景！ThehighselectivityofProteinAandProteinGfortheFcregioneffectivelyexcludesmostotherproteinsfrombinding.WhatisthedifferencebetweenProteinAandProteinG?SeenextslideSelfexplanatoryslideInformationIn1972,twopapersdescribingaffinitypurificationofIgGonimmobilizedproteinAwaspublished.WiththeemergenceofMAb,thepurificationmethodbecamethechoiceforacademicsandindustries.TheprimarybindingsiteforproteinAandGisFcportionofIgGatthejunctureoftheconstantdomainsCg2andCg3.Strongbindingrequiresharshconditionstodisruptthebinding.Bindingconstant10-6-10-8ProteinGisderivedfromStreptococci.ThewildtypeproteinGcontainsalbuminbindingdomainaswellasIgG-FcandFabbindingdomains.InProteinGSepharose,arecombinantproteinGwherealbuminbindingdomainhavebeendeletedisused.ProteinGbindsIgGmorestronglythanproteinA.HoweverthemonoclonalswhichshowweakbindingtoproteinG,alsoshowweakbindingtoproteinA(mouseIgG1andratIgGs.BindingisstrongestatpH5.0.*ElutionrequireslowpH,pH3inthecaseofProteinG.Thefractionsarecollectedinasmallamountofneutralisingbuffer,e.g.1MTris-HCl,pH7.5,toreducetheriskofdenaturationoftheantibody.*HerewecanseeacomparisonoftherelativebindingstrengthsofproteinGandproteinAtodifferentimmunoglobulinsandspecies.Iamawareofthatitisdifficultforyoutoseealldatainthetables,butwhatIwanttopointoutisthattherearedifferencesinspecificityandbindingstrengthtoIgGsfromdifferentspecies.SoifProteinAdoesnotwork–tryProteinG!AnotherpointisthatsomeclassesofantibodiesmaynotbindtoeitherproteinGorA.Iwillcomebacktothatlater…*生物分离与纯化实验共34学时持续改进协作实验报告：