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*第四章

微生物细胞破碎微生物代谢产物分泌到细胞外，称为胞外产物；目的产物存在于细胞内部，称为胞内产物。第一节细胞壁的组成与结构微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌酵母霉菌壁厚20-80nm10-13nm100-300nm100-250nm层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖(40-90%)多糖胞壁酸蛋白质脂多糖(1-4%)肽聚糖(5-10%)脂蛋白脂多糖(11-22%)磷脂蛋白质葡聚糖(30-40%)甘露聚糖(30%)蛋白质(6-8%)脂类(8.5-13.5%)多聚糖(80-90%)脂类蛋白质一、细菌细胞壁主要化学成分：肽聚糖；主要阻力：肽聚糖的网状结构。细菌细胞壁肽聚糖结构示意图二、酵母细胞壁主要化学成分：葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质和脂类；主要阻力：壁结构交联的紧密程度和它的厚度。酵母细胞壁的结构示意图三、霉菌细胞壁红面包霉菌细胞壁的结构示意图化学成分：几丁质和葡聚糖；主要阻力：几丁质或纤维素的纤维状结构。四、细胞壁结构与细胞破碎在机械破碎中，细胞个体小、球形、壁厚、聚合物交联程度高是最难破碎的。第二节常用破碎方法一、珠磨法(beadmill)细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，研磨剂与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。R——破碎率（%）01K——破碎速率常数（1/s）02t——间歇操作时的破碎时间，连续操作时为细胞悬浮液在破碎室内的平均停留时间（s）03ln[1/(1-R)]=Kt珠磨法破碎动力学方程珠体直径实验室规模研磨机0.2mm，工业规模不得小于0.4mm；珠体的装量宜控制在80%珠体体积/腔体自由体积；细胞浓度最佳的细胞浓度应该用实验来确定；123654操作温度搅拌器转速与构型料液性质与K有关的操作参数总的来说：延长t，增加珠体装量，提高搅拌转速和操作温度等都可有效提高R。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。因为高的R，能耗大；产热多，冷却难度大；产物失活损失增加；细胞碎片小，不易分离。珠磨法二、高压匀浆法利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环而使细胞破裂。R——破碎率Kt——与温度等有关的破碎常数n——循环操作次数p——操作压力a——与微生物种类有关的常数ln[1/(1-R)]=Ktnpa高压匀浆法破碎动力学方程压力工业生产中，通常压力为55～70MPa温度高温只适用于非热变性产物菌体种类菌体生长环境1234影响高压匀浆法破碎的因素03不适用于团状或丝状真菌、较小的革兰氏阳性菌及有包含体的基因工程菌02适用于酵母和大多数细菌细胞01是大规模细胞破碎的常用方法高压匀浆法高压匀浆法与珠磨法比较高压匀浆法珠磨法操作参数少易确定，适于大规模操作多凭经验估计操作次数2-4次循环才达高的R一次可达高的R菌种除丝(团)状真菌、小的G+及有包含体的基因工程菌外各种微生物三、超声破碎法(Ultrasonication)一般认为的机理是：在超声波作用下，液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。超声波法的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能及处理时间有关。超声破碎法的特点适应于实验室规模的应用易失活物质不宜用G-菌破碎效果好，酵母效果差01利用酶反应，分解破坏细胞壁上的特殊键，从而达到破壁的目的。02有两种酶溶法：外加酶法、自溶法。、酶溶法1、外加酶法酵母细胞：蛋白酶→蛋白质-甘露聚糖葡聚糖酶→葡聚糖层革兰氏阳性菌——溶菌酶革兰氏阴性菌——溶菌酶、EDTA螯合剂放线菌——溶菌酶酵母、霉菌——蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶植物细胞——纤维素酶、半纤维素酶条件温和，核酸泄出量少，选择性释放产物，细胞外形完整。优点：01酶价格高，通用性差，产物抑制的存在。缺点：02外加酶法的特点利用微生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。01可控制一定的条件使微生物产生过剩的溶胞酶或激发该酶的活性。02缺点：易引起所需蛋白质变性；自溶后，细胞悬浮液粘度上升，过滤速率下降。032、自溶法五、化学渗透法使用某些可以改变细胞壁或膜的通透性的化学试剂，使胞内物质有选择地渗透出来，称为化学渗透法。?表面活性物质：促使细胞壁或膜某些组分溶解常用的表面活性剂：十二烷基磺酸钠、TritonX-100和吐温(Tween)等EDTA螯合剂：与细胞壁或膜结构中Ca2+或Mg2+螯合化学渗透法的试剂及其原