丁香假单胞菌重组系统的构建及应用.pdf

摘要

丁香假单胞菌能在全球范围内引起毁灭性植物病害，其发病率是十大细菌性植

物病害之首，给农业生产造成巨大的经济损失。深入研究丁香假单胞菌致病机理及

毒力岛中致病相关基因的功能可为防治丁香假单胞菌病害提供理论依据。在丁香假

单胞菌的基因功能研究中，通常采用导入自杀性质粒完成重组或基因敲除，该操作

技术繁琐、耗时长。而源于λ噬菌体的Red重组系统无需构建特殊的打靶质粒，仅

exobetagamPCR

由、和基因所编码的蛋白即可发挥同源重组功能，利用扩增的线

性片段直接打靶，操作简便，成功率高，在许多革兰氏阴性菌中已有应用。

为满足研究植物病原菌分子机制的工具需要，本论文以丁香假单胞菌丁香致病

变种B728a（Pseudomonassyringaepv.syringaeB728a,PssB728a）为研究对象，对

RedpSRKpKD46Red

重组系统进行改良。以广宿主表达质粒为骨架，结合的重组

酶和pK18mobsacB质粒上的sacB负筛选元件，构建适用于PssB728a的Red重组

工具载体pRed01。在此基础上，本实验对抗性标记、启动子、重组酶进行优化，分

别得到了pRed02、pRed03、pRed04重组质粒。通过检测重组酶的转录水平和靶标

Psyr_1621Psyr_3467Psyr_3440

基因、和重组子的阳性率以验证系统的效率，并以

菌株信号分子AHL的合成量与运动性等表型进一步验证靶标基因是否被成功敲除。

FLP/FRT系统通常与λRed重组系统结合使用，本实验基于pRed重组系统和FLP/FRT

系统，对靶基因敲除盒进行优化。FRT-cassette的设计能破坏靶基因结构而不影响下

N

游基因序列的阅读框架，有效避免极性效应的发生；同时在靶基因下游基因端插

入His-Tag，可用于检验下游基因是否正常转录与翻译。

综合本项目研究结果如下：（1）pRed02能在PssB728a中稳定复制并传代，Red

重组酶基因可被L-阿拉伯糖诱导转录，稳定表达，且可介导Psyr_1621的全基因敲

Psyr_3467Psyr_3440N100%sacBFLP/FRT

除、和的端敲除，重组子阳性率为，和

可分别介导重组质粒的丢失和抗性基因的消除；（2）启动子优化后的pRed03可介

导Psyr_1621的全基因敲除，重组酶优化后的pRed04在PssB728a中没有获得重组

子；（3）通过优化靶基因敲除盒，pRed02可实现对Psyr_3440进行N端基因敲除，

获得的突变株用Psyr_3440回补后能部分恢复其群泳运动表型。

I

综上结果可得出关于在丁香假单胞菌中重组系统构建的结论：（1）pRed重组系

统可介导丁香假单胞菌基因重组，并能顺利退出，可进行突变体多个基因的分步敲

2

除，比传统方法更快速、便捷和精确；（）启动子优化后的重组系统中，可介导在

3

丁香假单胞菌中的基因敲除；重组酶优化后重组系统在丁香假单胞菌中不适用；（）

优化重组系统中靶基因的敲除盒，可实现下游基因的正常转录翻译，有效避免了极

性效应的发生。本研究可为在丁香假单胞菌中开展基因功能研究建立一套基因重组

系统，也为其它假单胞菌属细菌或