碱性磷酸酶米氏常数的测定ppt课件.pptxVIP

实验八碱性磷酸酶米氏常数的测定

;一、目的要求;二、原理;（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析

1．原理

Beer-Lambert（比尔）定律：

T=I/I0

A=lg1/T=lgI0/I

A=KCL

其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射光强度；I为透射光强度；

K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度

;2．常用方法

（1）标准曲线法

OD或Ａ

浓度

标准曲线与样品的测定条件必须一致。;（2）标准管法

CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可求得CX。

（3）摩尔吸光系数法

C=A/?（?为L=1cm，C为1mol/L时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。;1/v

1/Vm

-1/Km1/[S]

本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解的Km和Vm.

反应式：pNPP+H2OpNP+HPO42-

无色黄色

可通过分光光度法测定产物pNP的含量，求出反应速度v。;二、分光光度计的使用;;仪器操作键介绍

“方式设定”键（MODE）：用于设置测试方式——透射比（T）、吸光度（A）、已知样品浓度值（C）、已知标准样品斜率（F）

“100%”键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)

“0%”键：用于自动调整零透射比

“波长设置”旋钮：用于设置分析波长

;3.样品测试操作

①打开电源开关，使仪器预热20分钟

②用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上

③按“方式键”（MODE）将测试方式设置为透射比（T）

④将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中

⑤打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿和黑体分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖

⑥盖好样品室盖，将黑体推或拉入光路，按“0%”键调透射比零

⑦将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%”调100.0

⑧按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度（A）

⑨将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数

实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。;三、操作方法;(二）测定

15??试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照。

No.12345

底物终浓度[S](mM)0.50.751.01.53

10mmol/LpNPP（mL）0.10.150.20.30.6

蒸馏水（mL）0.50.450.40.30

0.1N碳酸盐缓冲液（mL）各加1.0mL

20mmol/LMgCl2（mL）各加0.2mL

预热混匀，37℃，5分钟

酶液（mL）测定管各加0.2mL酶液

反应时间37℃，精确反应10分钟

0.1NNaOH（mL）各加2mL

酶液（mL）空白管各补加0.2mL酶液

OD405;（三）数据处理

各管在722分光光度计测定波长405nm的OD值(OD405nm)。从对硝基苯酚标准曲线上查出OD405nm相当于产物对硝基苯酚的含量(?mol数),计算出各种底物浓度下的初速度vo（单位以?mol?L-1?min-1表示），取倒数1/v填入表内。以1/v对1/[S]作图，求出酶