目的基因的获取.pptVIP

妙用RNaseH这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断。DNAPolI除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。mRNAcDNA3’5’反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’5’引物mRNAcDNA第一链3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二链cDNA第一链3’5’RNaseHDNAligase去引物在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。5.cDNA与载体连接：接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶6.cDNA文库的大小一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文库包含了完整mRNA的概率（99%）:某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例N：所需的重组载体数（克隆数）1n1ncDNA文库与基因组文库相比的优越性表现在cDNA文库以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒，例如流感病毒；因其不通过DNA中间体，所以研究其唯一的方法就是cDNA克隆。cDNA基因文库的筛选比较简单易行。由于每一个cDNA克隆都含有一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率比较低，而相比之下基因组文库克隆的选择较复杂，假阳性的概率就高。他的文库所含的克隆数是基因文库的十分之一，或更少。原因是：高等真核生物与原核生物在结构组成上的最大区别是前者含有内含子间隔序列，而后者没有。通过基因文库中筛选的目的基因难以在原核生物中表达。而cDNA是经过转录后得来的其内含子部分已被删除。cDNA克隆可用于在细菌中能进行表达的基因克隆，直接应用于基因工程操作。一种特异的mRNA在细胞中往往占很小的比例，难以直接研究其序列、结构和功能。一般是通过比较基因组进行确定cDNA克隆还可以用于真核细胞mRNA的结构和功能的研究cDNA文库与基因组文库相比的缺点A受材料来源的影响B遗传信息量有限C构建的cDNA文库中高丰度的（含量）mRNA含量比低丰度的易得和分离，其实现在构建的cDNA基本上是高丰度的而低丰度的很少D三、文库的查询（screening）用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southernblot杂交。文库载体探针电泳后杂交放射自显影测序分析基因文库分离法PCR分离法化学合成法直接分离法目的基因的获取方法0103020404030102第三节PCR扩增获得目的基因如果知道目的基因的全序列或其两端的序列，通过合成一对与引物互补的引物，就可以十分有效的扩增出所需的目的基因。省时省力1.直接从基因组中扩增（1）提取基因组DNA作模板（2）根据目的基因序列设计引物（3）PCR扩增真核生物基因组含有内含子！适合扩增原核生物基因。原核基因组部分原核细胞提取基因组DNAPCR扩增（1）提取基因组totalRNA（2）反转录合成总cDNA作模板（4）PCR扩增（3）根据目的基因序列设计引物2.从mRNA中扩增:RT-PCR原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。适合扩增真核生物基因。目的基因的引物1反转录成目的基因cDNA第一链目的基因的引物2目的基因cDNA第二链PCRmRNA第四章目的基因的获取目的基因：开读框起译码ATG休止码TAG、TAA、TGA转录终止区转录启动区核糖体识别区编码区结构基因的组成基因文库分离法1PCR分离法2化学合成法3直接分离法比较各种方法获得目的基因的优缺点4目的基因的获取方法第一节直接分离法一、限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。酶切1.优点由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。2.缺点目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！BamHIBamHIBamHIgene应用对象适合于从简单的基因组中分离目的基因,如质粒或病毒的大小只有几千碱基,大的也超不过几十万碱基,编码基因比较少,获得也比较简单.1、对已定序列的DNA分子，只需要用已知识别序列的限制性内切酶进行一次或几次切割，分离纯化所需要的DNA片断，与适当载体连接。2、对已知定位的目的基因，只要根据目的基因两侧的已知的酶切识别位点，一次就可以获得。3、