细胞的研究方法.pptVIP

2.负染色技术用重金属盐对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸出处则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。用磷钨酸钾染色（a）和铬镀膜后(b)的烟草rattle病毒电子显微图3.冰冻蚀刻技术①将标本于-100℃干冰中或-196℃液氮中，超低温冰冻。②然后用冷刀骤然将标本冲断开，升温后冰在真空条件下迅即升华，暴露出了断裂面结构－蚀刻(etching)。蚀刻断裂冰冻蚀刻技术的操作步骤:(freeze-etching)复膜显示出了标本蚀刻面的形态，可置于透射电镜下观察。电镜下的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。③蚀刻后，再向断裂上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下，此膜即为复膜(replica)。复膜细胞冰冻断裂后的电镜图像4.扫描电镜技术电子枪发射出的电子束作为“探针”，在样品表面进行扫描，电子束激发样品表面放出次级电子，被电荷的探测器收集后，在荧光屏上相应位置显示出明、暗差别。用来观察标本的表面形态结构。(scanningelectronmicroscope,SEM)010302扫描式电子显微镜耳听毛的扫描电镜图像第二节细胞组分的分析方法一、超速离心技术为了研究细胞的各种结构和成分的化学性质和生理功能，需要把它们分离和抽提出来进行研究。离心是研究细胞器和生物大分子的必要手段。离心机结构与原理示意图马达冷冻真空沉降物转子装甲室01?差速离心02?密度梯度离心密度梯度离心与差速离心结合可达到更精细的分离。离心分离技术差速离心在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的亚细胞组分和各种颗粒。利用肝脏制备各种亚细胞组分的制备离心过程示意图匀浆物肝脏上清夜完整细胞完整细胞1000g20min核线粒体溶酶体过氧化物酶体微粒体内质网100000g120min105000g20min静置20min10000g20min核糖体密度梯度离心

（区带离心法）用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。等密度沉降：用于分离不同密度的细胞组分，常用介质为氯化铯02速度沉降：用于分离密度相近大小不一的细胞组分，常用介质为蔗糖01密度梯度离心常用的介质：蔗糖、氯化铯等。二、细胞化学技术组织化学和细胞化学法

免疫细胞化学法（特异蛋白抗原的定位与定性）01Feulgen反应 ——DNA苏丹染色——脂肪和胆固醇Millon反应 ——蛋白质组织化学和细胞化学染色方法依据化学反应原理，对无色透明细胞的某些成分进行定性和定位研究。02（一）、组织化学和细胞化学技术免疫细胞化学是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原结合，对抗原进行专一定位测定的技术。01免疫细胞化学(immunocytochemistry)02抗体与抗原的结合方法可分为以下两种：在抗体抗原初级反应的基础上，再用带标记的次级抗体与初级反应物反应，从而使初级反应得到放大，增强显示效果间接法直接法将带有标记的抗体与抗原反应，显示出抗原存在的部位免疫---荧光技术不同荧光染料标记抗体特异性结合抗原(细胞的蛋白质成分)不同荧光染料直接荧光染色直接免疫荧光抗体2标记间接免疫荧光不同荧光染料DNA序列测定技术（主要利用的測序仪）01核酸分子杂交技术（molecularhybridizationtechnique）02PCR技术（聚合酶链式反应）03三、细胞内特异核酸序列的定位与定性（二）核酸分子杂交技术原理是两条具有互补序列的单链核酸分子片断，在适当的实验条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA双链分子的过程。原位杂交（insituhybridization）。1用来检测染色体上的特殊DNA序列。用已知的带有标记的特定核酸分子作为探针，来测定与之成互补关系的染色体DNA区段的位置。2人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片Southern杂交是体外分析特异DNA序列的方法.六种限制性内切酶酶切真鲷基因组DNA的电泳结果和Southernblot(B)杂交结果，箭头示杂交带根据双链DNA的变性与复性和分子杂交原理设计出的技术，目的是将极微量DNA体外大量扩增。(聚合酶链式反应,PolymeraseChainReacti