L-苯丙氨酸及衍生物生物传感器构建与应用.pdf

摘要

L-苯丙氨酸（L-Phe）是重要的食品及医药中间体，在食品、药品、化工等多个

领域应用广泛。通过代谢工程改造提高L-Phe产量，一方面是利用游离型质粒过表

达目标基因，但需要添加诱导剂、抗生素等成分，增加了工业生产成本；另一方面

是利用常规的基因组编辑技术对多个不同模块内的多个基因进行逐轮迭代改造，但

由于L-Phe的代谢途径较长而且调控机制复杂，难以实现不同模块之间的通量平衡，

在一定程度上限制了其产量的进一步提升。

本研究通过基于CRISPR/Cas系统和胞苷脱氨酶的无模板基因表达调控技术（Base

Editor-TargetedandTemplate-freeExpressionRegulation，BETTER），将L-Phe生物合

成途径的来源于谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）的aroE、tktA、ppsA

fbrfbr

以及来源于大肠杆菌（Escherichiacoli）的aroL、tyrB、pheA、aroF基因整合到

PGGGGGGGG

谷氨酸棒杆菌基因组中，并针对每个基因赋予组成型启动子及构

11F

RibosomebindingsiteRBS

成的待编辑核糖体结合位点（，）。利用本课题组开发的针

对L-Phe的可在体外使用的荧光蛋白型生物传感器，结合液滴微流控筛选系统

（Dropletmicrofluidics），筛选无质粒的L-Phe高产菌株。从大约七万个RBS突变文

库中筛选到四株L-Phe产量提升不同程度的突变菌株C.g-Mut1、C.g-Mut2、C.g-

Mut3、C.g-Mut4，24h孔板发酵产量分别为0.14mM、0.35mM、1.05mM、1.58

mMC.g-20.008mM174313019772h

，相比对照菌株（）提高了、、、倍；摇瓶发酵

2.06mM1.30mM4.42mM7.44mMC.g-20.6mM

产量分别为、、、，相比对照菌株（）

提高了2、1、6、11倍。这充分证明了利用碱基编辑器同时调节多基因的表达水平

并筛选组合文库，可以为L-Phe工程育种提供一种可行策略。

此外，S-β-苯丙氨酸（S-β-Phe）是具有生物活性的天然产物的重要成分及抗生

素前体，目前报道的合成S-β-Phe的酶催化效率较低，需要加以改造提高催化活性，

酶的定向进化势必会产生数量庞大的突变文库，需要高通量筛选工具。本研究在课

题组前期基础上，对现有的L-Phe生物传感器底物结合蛋白GrsA进行改造，改造位

点A236V，T328C，T329-，I330L，C331V，使其能够特异性识别S-β-Phe，检测底

物范围1-500μM，荧光动态范围可达226%，为后续酶的定向进化提供了可靠的高通

量筛选工具。随后在大肠杆菌BAP1中异源表达来源于粗糙链霉菌Streptomyces

scabrisporus的苯丙氨酸氨基变位酶HitA，通过易错PCR方法构建突变文库，在孔

板中利用S-β-Phe生物传感器对突变酶的全细胞催化产物进行筛选，总计筛选4000

个突变体，但是没有筛选到催化活性提高的突变体。

关键词：L-苯丙氨酸；生物传感器；高通量筛选；谷氨酸棒杆菌；多基因同步调控；

碱基编辑技术；S-β-苯丙氨酸

ABSTRACT

L-Phenyla