黑曲霉脂肪酶Tgl的催化特性及其酯化能力研究.pdfVIP

摘要

脂肪酶在一定条件下可以催化酯化反应生成酯类物质，在食品、洗涤剂、皮革、

保健、制药、能源等多种领域中有着广泛的应用。本课题组在前期研究中通过对黑曲

霉转录组分析，挖掘得到多个编码脂肪酶的基因，发现部分脂肪酶基因在一定条件下

具有合成脂肪酸乙酯的能力，在酯类等风味物质合成方面具有很大的应用潜力。为深

Aspergillusniger

入研究黑曲霉脂肪酶的酯化反应分子机制，本论文对黑曲霉（

CBS513.88Tgl

）来源的脂肪酶进行异源表达，并对其酶学性质、结构特性、酯化能

力等进行研究，在此基础上对其进行分子改造。

TglTgl

本研究成功将脂肪酶基因在大肠杆菌中异源表达和分离纯化，并对脂肪酶

TglpH50℃5.0

进行酶学性质分析和酯化特性分析：的最适作用温度和为和，在

2+

40-50℃和pH为4.0-6.0条件下Tgl具有较好稳定性；Mn对Tgl的活性有促进作用；

有机溶剂对Tgl的催化活性有不同程度的抑制作用，其中正己烷和DMSO对Tgl的抑

制作用最小；底物谱分析发现Tgl对中短链的对硝基苯酚酯的K值较小，说明Tgl

m

对中短链的底物亲和力较高，因此Tgl对中短链的对硝基苯酚酯的水解活性较高。分

别在20%和60%乙醇作为溶剂的反应体系中定量分析脂肪酸乙酯的生成量，并研究酸

醇比对产物生成量的影响。结果发现脂肪酶Tgl在60%乙醇反应体系中，对中长链脂

肪酸乙酯的催化能力较高，其中己酸乙酯和庚酸乙酯的生成量分别为171.08mg/L和

115.62mg/L20%31

；在乙醇反应体系中，当乳酸和乙醇浓度为：时，乳酸乙酯的合

成量最高，为79.09mg/L。

TglTgl

基于生物信息学分析，对其进行定点突变：对脂肪酶多序列比对、同源

建模、分子对接与分子动力学模拟分析，确定脂肪酶Tgl的活性中心位点Ser139、

Asp195His2481

和。为进一步提高其催化活性，选择三种策略进行分子改造：（）选

择活性中心口袋附近的3个氨基酸残基酸Thr50、Thr73和Ser74，分别突变为甘氨酸

（T50G、T73G、S74G）；（2）将A75-D83位的“盖子”结构去掉（ΔGZ）；（3）

选择活性中心附近的氨基酸残基His138、Gly141、Gly71和Thr73，突变为丝氨酸，

进行两两组合突变（H138S/G141S、G71S/T73S）。获得稳定性和催化效率均得到大

幅提高的突变体T73G，在50℃下，比酶活较野生型提高了46%，对pNP-C6的催化

效率（K/K）提高了3.5倍。

catm

为进一步提高催化效率，对73位的苏氨酸进行简并密码子为NNK策略的饱和突

60%T73YT73NT73N

变，结果发现，在乙醇的反应体系中，突变体、、对中长链对

硝基苯酚酯的酯化能力远大于水解能力，其中T73N催化合成己酸乙酯、辛酸乙酯和