血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳.ppt

血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳第六组蛋白质的分离蛋白质是生物大分子化合物，具有胶体性质、沉淀、变性和凝固等特点蛋白质分离纯化的方法主要有：盐析、透析、超离心、电泳、离子交换层析、分子筛层析等方法。透析超速离心凝胶过滤层析离子交换层析电泳技术的原理电泳蛋白质在一定的pH溶液中可带有电荷，成为带电颗粒，在电场中向相反的电极方向泳动。由于蛋白质的分子量和电荷量不同，其在电场中的泳动速率也不同，从而将蛋白质分离成泳动速率快慢不等的条带。电荷的来源蛋白质带有可解离的氨基（-NH2）和羧基(-COOH),是典型的两性电解质，在一定PH条件下会解离带上电荷COO-COO-COOH╱+H+╱+H+╱Pr←————→Pr←————→Pr ╲+OH-╲+OH-╲NH2NH3+NH3+PHPIPH=PIPHPI迁移率电场力F=EQ（E：电场强度，Q：电荷)阻力F=6πγηυ（γ：半径，η：介质粘度）υ/E表示单位电场强度时粒子运动的速度，称为迁移率，也称位泳动度，以μ表示：μ=υ/E=Q/πγη可见，离子的迁移率在一定条件下取决于粒子本身的性质，即其所带的电荷和形状。不同的粒子有不同的迁移率，因此电泳一定时间就可分开它们。样品性质与分离样品所带电荷成正比，与样品相对分子质量成反比。电场强度电压越高，带点粒子移动越快。缓冲液的性质缓冲液的PH值距等电点越远指点所带静电荷越多，迁移速度越快；反之越慢。离子强度等于1/2∑cizi2支持介质理想电泳支持介质应是网状结构、不带电荷、对被分离物质无吸附作用的惰性材料。温度影响电泳分离效果的因素12纸质电泳醋酸纤维素薄膜电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳根据固体支持物种类的不同薄膜电泳垂直板电泳平板电泳垂直圆盘电泳根据电泳装置不同电泳的分类醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳是以醋酸纤维薄膜为支持物的电泳。醋酸纤维素是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成。具有色带清晰，分辨率高；成本低廉，简介快速；样品用量少，灵敏度高，临床检验应用广泛等优点。醋酸纤维素薄膜电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场力作用下能产生较强电渗作用，因此用于作为电泳支持物。琼脂糖凝胶电泳具有：操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳；电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好；可直接用于紫外检测；易染色易洗脱等优点。尤其适合核酸的分离。琼脂糖凝胶电泳掌握电泳的基本原理，了解电泳仪、电泳槽的基本结构与功能。熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本过程。实验目的聚丙烯酰氨凝胶电泳实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳一般可分成12～25个组分。因此适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。根据有无浓缩效应可分为：连续系统与不连续系统，其中不连续系统因具有浓缩效应，分离条带清晰度及分辨率较佳应用更为广泛，本次试验应用的为不连续系统。三大效应浓缩效应：浓缩胶的浓度小于分离胶的浓度，因凝胶孔径的不连续使样品迁移受阻而压缩成很窄的区域，从而提高分离效果。缓冲液离子成分、PH的不连续性也能造成浓缩效应：电极缓冲液通常为pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液，样品及凝胶（浓缩胶）中缓冲液为pH6.7Tris-HCL缓冲液。电极缓冲液的pH=8.3，甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，蛋白质夹在中间而被压缩。1cm厚样品层可以压缩0.25μm的厚度。分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，