聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离血清蛋白.ppt

聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离血清蛋白【实验目的】1.学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理2.掌握聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳的操作技术【实验原理】聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂N,N’-甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂过硫酸铵（简称AP）和加速剂N,N,N’N’-四甲基乙二胺(简称TEMED)的作用下,聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离原理分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。浓缩效应【实验器材】样品：血清凝胶储备液：1号液：pH8.9Tris~HCl缓冲液+TEMED2号液：Acr+Bis3号液：AP电泳缓冲液：pH8.3的Tris-Gly缓冲液染色液：氨基黑溶液脱色剂：冰乙酸【实验器材】电泳仪、圆盘电泳槽、电泳玻璃管、青霉素小瓶盖、微量注射器、长针头注射器、烧杯、移液管、ParaFilm膜。【实验步骤】凝胶的制备准备工作：用ParaFilm膜密封细橡皮塞的一端，塞入放到木质试管架上的小瓶塞中；（2）制备小孔胶（分离胶）凝胶浓度:7.5%试剂用量蒸馏水1号液2号液1mL1mL2mL混匀3号液4mL用滴管吸取凝胶沿管壁装入玻璃管中，检查管内无气泡，加完凝胶后沿管壁缓缓注入几滴蒸馏水，聚合约40-60分钟；时间到后，轻轻取下管底部的橡皮塞和ParaFilm膜，用滤纸吸取凝胶上方水层，将凝胶管垂直插入电泳槽圆孔中并尽量使各管高度一致，其余孔用胶塞堵住，电泳槽内加注电泳液；灌胶，装胶”负极在上，正极在下，电流调节到2mA/管，开通电源；2min后，电流调节到5mA/管，电泳约1h左右，直到溴酚蓝跑到凝胶底部。4.电泳：用微量注射器吸取20/50ml的样品（含溴酚蓝），沿内壁缓慢加入，注意观察样品的状态变化；3.加样：贰壹剥胶