液体发酵生产桑黄多糖技术规程.docxVIP

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DB43/TXXXX—2021

液体发酵生产桑黄多糖技术规程

1范围

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本文件拟规定液体发酵生产桑黄多糖的主要技术指标和要求，包括发酵工艺、提取方法、含量测定、质量标准等规范。

本文件适用于湖南省内液体发酵生产桑黄多糖。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB4806.7食品安全国家标准食品接触用塑料材料及制品GB5749生活饮用水卫生标准

GB/T12728食用菌术语

NY/T528食用菌菌种生产技术规程NY/T1731食用菌菌种良好作业规范

3术语和定义

GB/T12728界定的以及下列术语和定义适用于本文件。

3.1桑黄多糖Phellinuslinteuspolysaccharides

桑黄多糖是从桑黄中提取的有效成分，能够提高人体的免疫力，抵制癌细胞，而且还具有其它的食疗作用。

3.2硫酸-苯酚法sulfuricacidphenolmethod

利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，再以比色法测定。

4液体发酵产多糖

4.1菌种生产

菌种的生产应符合NY/T528和NY/T1731的规定，母种宜使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）

4.2发酵培养基

按照附录A规定配制。

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DB43/T1907—2020

4.2装液量

采用1000mL的常规三角瓶，每瓶装液量为200mL～300mL，八层纱布和牛皮纸封口。

4.3灭菌

在121℃~126℃,0.14MPa～0.17MPa的压力下，保持25分钟。

4.4接种

将灭菌后的培养基冷却至30℃以下，无菌条件下用打孔法（10mm孔径）将菌丝接种到液体摇瓶培养基上，按每100mL液体培养基接种3个菌丝块。

4.5培养

接种后移至摇床，26℃,130r/min条件下培养10天。

5粗多糖的提取

5.1发酵上清液收集

发酵后的菌液5000rpm、4℃条件下离心15min，弃去沉淀，收集上清。

5.2三氯乙酸处理

上清液中缓慢加入浓度为800mg/mL三氯乙酸，使其终浓度为40mg/mL，4℃静置8h后10000rpm、4℃条件下离心10min，弃去沉淀，收集上清。

5.3无水乙醇处理

按1:4的体积比向上清液中加入无水乙醇，4℃过夜，10000rpm、4℃条件下离心10min后收集底部沉淀。将沉淀溶于60℃蒸馏水中，10000rpm离心10min，弃去底部不溶沉淀，收集上清。

5.4透析

将上清液装入截留分子量为8KDa的透析袋内，透析2h～4h后，更换透析液，之后每6h～8h更换一次透析液，连续透析2d。收集透析袋内多糖溶液，真空冷冻干燥制得乳酸菌粗多糖。

6多糖的纯化

6.1离子交换纯化

6.1.1层析柱填装

将DEAE-SepharoseFastFlow填料装填于ColumnXK26/40（内径：26mm，高度400mm）层析柱中，体积为150mL，用Tris-HCl溶液（55mM，pH7.5～7.8）以1.5mL/min流速过夜平衡层析柱。

6.1.2过柱分离

将粗多糖溶于Tris-HCl中，配成浓度为10mg/mL溶液，0.22um滤膜过滤后上样。流动相使用Tris-HCl和含1MNaCl的Tris-HCl洗脱液，将蛋白质核酸纯化系统的流速设置为2.0mL/min，每3min收集一次洗脱液至试管中。

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DB43/TXXXX—2021

6.2分子筛纯化

6.2.1层析柱填装

将SephadexLH-20装填于ColumnXK16/100（内径：16mm，高度1000mm）层析柱中，体积为

150mL，用Tris-HCl溶液（55mM，pH7.5～7.8）以0.5mL/min流速过夜平衡层析柱。

6.2.2过柱分离

将上一步纯化收集得到的多糖组分溶于Tris-HCl中，配成浓度为5mg/mL溶液，0.22μm滤膜过滤后上样。流动相使用Tris-HCl洗脱液，流速为0.5mL/min，每10min收集一次洗脱液至试管中。

将得到的多糖进行冷冻干燥。

7苯酚-硫酸法测定多糖含量

7.1葡萄糖标准液的配制

称取葡萄糖100mg，