细胞核的分离与纯化及RNA、DNA的定量测定.pptVIP

*****?并且单个核苷酸或者是脱氧核苷酸都是由三种成分组成的？还记得是哪三种吗？是由戊糖(即五碳糖)、碱基、和磷酸三部分构成的。?我们今天采用的是可见光分光光度计，之前说过，可见光分光光度计对于待测溶液有一个条件，什么条件？那就是待测溶液必须要有颜色，那DNA，和RNA有颜色吗？没有，所以我们就要通过化学反应，生成有颜色的物质，从而通过有颜色物质的量来反映DNA或者是RNA的含量。?今天测定RNA，以及DNA的方法采用的就是将RNA或者DNA进行水解，然后测定水解液中戊糖含量的多少来反映RNA与DNA的含量。也就是所谓的定糖法。?***********喻娟娟生物化学与分子生物学教研室联系电话:Email:细胞核的分离纯化及RNA、DNA的定量测定实验六了解细胞核分离纯化的基本原理和方法掌握DNA、RNA定量测定的原理及方法掌握离心机的使用一、细胞核的分离与纯化（上午）二、RNA的定量测定三、DNA的定量测定

（下午）一、细胞核的分离与纯化DNA、RNA在细胞中的分布：1DNA2胞核内(98%)3胞质内(2%)4RNA5胞核内(10%)6胞质内(90%)7核酸的种类：8DNA、RNA9结论：DNA主要存在于细胞核，RNA主要存在于细胞质。10二、核酸的种类及其分布三、核酸的鉴定核酸核苷酸磷酸碱基戊糖定糖法（戊糖的差异）（1）核糖核酸RNA的测定浓HCl＋3H2O+β－D－核糖糠醛糠醛3，5－二羟基甲苯绿色化合物RNAＯＨˉ水解β－D－核糖地衣酚法:（2）脱氧核糖核酸DNA的测定DNAＨ＋水解β－D－２－脱氧核糖-H2O硫酸脱氧核糖ω－羟基－γ－酮基戊醛蓝色化合物二苯胺法:试剂与器材1、0.25mol/L蔗糖柠檬酸（含3.3mmol/LCaCl2）

称取蔗糖86g及CaCl2363mg，用1.5％拧檬酸液溶解并稀释至1000ml。2、0.88mol/L蔗糖柠檬酸液（含3.3mmol/LCaCl2）

称取蔗糖301g及CaCl2363mg，用1.5％柠檬酸液溶解并稀释至1000ml。3、核洗液：即0.05mol/L，Tris—HCl（pH7.5）－0.15mol/LNaCl液。在0.2mol/LTris—HClpH7.5缓冲液250ml中加NaCl8.7g再用蒸馏水稀释至1000ml。4、1.5％拧檬酸5、0.9％NaCl6、0.02NNaOH7、离心机8、水浴箱9、常规玻璃仪器（1）肝细胞匀浆的制备用颈椎脱臼法杀死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，除去结缔组织，尽快置于盛有0.9%NaCl的小烧杯中，反复洗涤，尽量除去血液。洗完后将肝脏一分为二，每个小组半个肝，直接将半个肝放在小烧杯里剪碎，剪碎的肝脏放入匀浆器中，加入1.5％柠檬酸钠溶液4.5ml，反复研磨制成匀浆，从而破碎细胞。研磨完后，将匀浆液用单层纱布进行过滤，以除去未研碎的组织。（2）分离细胞质和细胞核将过滤好的匀浆液，放入普通离心机，以3500r/min的转速，离心15min。缓慢倒出上清液（细胞质），移入另一试管中，保留待测定核酸时使用。余下的沉淀物为粗制的细胞核，加入0.25mol/L蔗糖-拧檬酸溶液1ml，用玻捧搅匀，制成细胞核悬液。另取离心管一支，先加入0.88mol/L蔗糖-柠檬酸液9ml，用滴管吸取上述核悬液，沿管壁缓缓铺于0.88mol/L蔗糖-柠檬酸溶液液面上，再以2000r/min转速离心10分钟，倾去上层液，将管倒立于滤纸上，以吸干余液。沉淀为初步纯化的细胞核。加入Tris－HCl－NaCl核洗液5ml洗涤沉淀，以2000r/min离心10min，除去上层液。得到的白色沉淀即为纯化的肝细胞核。加5ml0.02mol/L的NaOH使细胞核溶解为核液，保留，待测定核酸。0.88mol/L蔗糖-柠檬酸溶液9ml核悬液0.25mol/L0.88mol/L初步纯化的细胞核其它的亚细胞结构半个肝脏＋1.5%柠檬酸溶液4.5ml，制成匀浆单层纱布过滤1次滤液离心：3500r/min；15