现代遗传学14遗传工程学.pptVIP

AEDBC尽可能采用粘端连接*载体脱磷以降低载体自连改进转化条件插入片段磷酸化提高插入片段和载体的比例如何提高克隆效率?有一外源片段用某种酶切,生成了5′突出粘性末端5′-GATC,但是载体上的单酶切位点只能生成下面这几种粘性末端:5′-CTAG5′-TCGA5′-TTAA应当采用怎样的策略来提高连接效率?问题:不依赖于内切酶和连接酶的体外重组---位点专一性重组（依赖于短片段同源序列的重组）cosN,LoxP01LoxP02LoxP03cre04LoxP05LoxP+reportgenesubstratesTransformRNA提取液总RNA过oligo(dU)柱洗脱mRNAAAAAAAAATTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAAAAArRNAtRNAmRNA新鲜组织研磨或匀浆用标记的核酸作为探针01用诱饵质粒筛选表达cDNA文库02筛选DNA文库同位素标记：32P01.非放射性标记：荧光标记，生物素，dig(地高辛）等02.标记物：探针标记变性01模板DNA02随机6核苷酸引物，dNTP,某种标记dNTPDNAPolI035‘04随机引物05标记的DNA片段06强调，几乎所有DNA酶作用都需要Mg++存在介绍每一种酶的特性和作用，以及可能用到的地方耐受性，指对外源片段产物毒性的耐受力突变率低：可以通过筛选突变型细胞株降低可能发生的重组，突变等事件，使得外源片段稳定传代分别介绍每种宿主的优缺点和适用范围前3项为连接条件的改善，简述单分子反应和双分子反应的反应动力学，说明操作原理，举例说明人为设计的拈端连接方法和末端转移酶的使用；脱磷的使用限制（一般PCR产物不能用载体脱磷方法）最后一项为转化条件的改善，感受态细胞制备以及热激或电击，或PEG介导的原生质体转化（对酵母系统）采用部分填平法造成2碱基的匹配粘性末端探针的标记酵母双杂交系统的原理，GAL4的两个功能域被分别克隆到2个载体，单独表达时没有相互作用，空间上分离，不能启动下游基因表达诱饵基因和受检测基因（群）分别克隆进2个载体，形成融合蛋白，如诱饵蛋白和受检蛋白有相互作用，则下游基因启动呈兰色反应。假阳性和假阴性产生的原因，如何设计对照实验和消除。原理：TAQ酶的特点，作用，反应条件对PCR结果的影响，设计引物需注意的地方TROUBLESHOOT，可能出现的问题和解决方法。Dd的缺陷Sage原理第十四章遗传工程利用转基因手段对生物进行人为改造的技术什么是遗传工程？体外DNA重组技术：利用工具酶将外源片段和载体连接，导入生物体并使其稳定复制和传代的技术目的研究工作生物产品(生物反应器)改良物种(提高品质)基因治疗剪切酶类有目的有选择的把目的片段切开2014连接酶类将目的片段和载体相连2015其他工具酶修饰,加工等作用2016工具酶限制性内切酶II及其产生的3种不同末端5突出的粘性末端3突出的粘性末端平末端EcoRIEcoRVPstIPPPPPP识别相同的位点,但生成不同的末端.贰同切酶:壹识别不同的位点,但产生相同的粘性末端肆同粘酶:叁同切酶和同粘酶0102SmaI5′...C^CCGGG...3′3′...GGGCC^C...5′5′...CCC^GGG...3′3′...GGG^CCC...5′XmaI同切酶0102035′...G^GATCC...3′3′...CCTAG^G...5′BamHI5′...A^GATCT...3′3′...TCTAG^A...5′BglII5′...^GATC...3′3′...CTAG^...5′Sau3A同粘酶连接酶及其对底物的要求:01T4Ligase,EcoliLigase02底物:03自由5’末端和自由3’末端,5’末端带磷酸基团04反应条件：Mg++，ATP存在05其它工具酶聚合酶(polymerase):DNA聚合酶I,klenow片段,Taq,Pfu,末端转移酶外切核酸酶(exonuclease):exo