谷丙转氨酶活性测定.pptVIP

实验十七谷丙转氨酶活性测定

Exp.17ActivityDeterminationofGlutamicPyruvicTransaminase一、实验原理氨基移换酶也称转氨酶,为广泛存在于生物机体内的酶，其作用为催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮酸的α-酮基互换。因此在氨基酸的合成和分解，尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。转氨酶的种类甚多。任何一种氨基酸进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化，它们的最适pH接近7.4。在各种转氨酶中，谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶）及谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶）活力最强。01上述两种转氨酶均广泛存在于机体组织内，在正常人血清中也有少量，机体发生肝炎。心肌梗塞等病变时，血清中转氨酶活力显著增加，所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。它们的催化反应如下：02COOHCOOHCOOHCOOHCHNH2+C=OC=O+CHNH2CH3(CH2)2CH3(CH2)2COOHCOOH转氨酶←→丙氨酸α-酮戊二酸丙酮酸谷氨酸→测定转氨酶活力的方法很多，如分光光度法，纸上层析法等。在本方法中，谷丙转氨酶作用于丙氨酸和α－酮戊二酸后，生成的丙酮酸与2,4－二硝基苯肼作用生成丙酮酸2,4－二硝基苯腙。本方法中用分光光度法，根据硝基苯腙的生成量可以计算酶的活力。二、实验用品1、材料新鲜动物肝匀浆。2、试剂（1）0.1M磷酸缓冲液（pH=7.4）取0.1MKH2PO4液50ml，0.1NNaOH液39.3ml，再加蒸馏水10.7ml，混匀即得。（2）丙酮酸钠标准液（2.0微克分子/ml）：取A·R丙酮酸钠11mg溶解于50ml0.1M磷酸缓冲液内（宜当日新配）。取分析纯α－酮戊二酸29.2mg，DL—丙氨酸1.79g置于小烧杯内，加1NNaOH约10ml至完全溶解。用1NNaOH或1NHCl校正其pH=7.4，加0.1M磷酸缓冲液稀释至100ml，然后加氯仿数滴防腐，在冰箱内可保存一周。此溶液每1.0ml含α－酮戊二酸2.0微克分子，丙氨酸200微克分子。谷丙转氨酶底物：将A·R纯2，4—二硝基苯肼19.8mg加入200ml锥形瓶内，加100ml1NHCl液。2，4—二硝基苯肼溶解较慢，把锥形瓶放在暗处不时摇动，全部溶解后，滤入褐色玻璃瓶。并置于冰箱中保存。2，4—二硝基苯肼溶液：仪器设备试管、吸量管、恒温水浴锅、分光光度计0.4N氢氧化钠液。三、方法和步骤肝匀浆制备：取新鲜动物肝脏，用生理盐水冲洗，滤纸吸干，称取肝脏0.5g，剪成小块，置于玻璃匀浆管内，加入4.5ml预冷的pH7.40.1mol/L磷酸缓冲液，制成10%肝匀浆，冰冻保存。标准曲线的绘制取6支试管分别用0、1、2、3、5标号，按下表所列次序添加各试剂。将试管于37℃水浴中保温，平衡管内外温度,向各管内加0.5ml2，4—二硝基苯肼后再保温20分钟，最后分别向各管内加入0.4NNaOH5毫升，在室温下静置30分钟后，以0号管做“空白”用520nm进行比色，读出光吸收值，以丙酮酸的微摩数为横坐标，光吸收值为纵坐标，画出标准曲线。表1.丙酮酸钠标准曲线的绘制管号试剂012345丙酮酸钠标准液/ml0.000.050.100.150.200.25谷丙转氨酶底物/ml0.500.450.400.350.300.25磷酸缓冲溶液(0.1MpH7.4)/ml0.100.100.100.100.100.1037℃水浴中保温，平衡管内外温度2，4-二硝基苯肼/ml0.500.500.500.500.500.50保温20分钟NaOH(0.4N)/ml555555静置30分钟A520nm2、谷丙转氨酶酶活力的测定1测定管2“空白”对照管谷丙转氨酶底物/ml0.500.5037℃水浴保温10min，使管内外温度平衡稀释肝匀浆/ml0.1037℃水浴保温30分钟2,4—二硝基苯肼试剂/ml0.500.50稀释肝匀浆/ml0.10保温20分钟，冷却NaOH(0.4N)