生物技术与人类未来.ppt

pUC118质粒的多克隆位点整合在lacZ即β-半乳糖苷酶的基因中，lacZ可以使细菌在含有IPTG（即乳糖操纵子的诱导物）和X-gal（即β-半乳糖苷酶的底物）的平板培养基上形成蓝色的菌落，即X-gal被lacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶水解成蓝色。但是，当外源DNA片段插入到多克隆位点区时，就破坏了lacZ基因的结构，使lacZ基因失去了活性和表达功能，大肠杆菌就形成白色菌落,即形成白色菌落的细菌是携带有插入片段重组质粒的细菌。（4)带有筛选标记－如lacZ基因的插入失活，筛选重组质粒第30页，共83页，星期日，2025年，2月5日（5)带有其他筛选标记：如pUC18载体携带了另一种筛选标记－抗生素（antibiotic）如氨卞青霉素抗性（AmpR）的基因。只有插入外源目的基因的宿主细胞能在含有氨卞的培养基板上生长，所以也可依此特性筛选重组质粒。含有重组质粒的宿主菌又称“转化子”。第31页，共83页，星期日，2025年，2月5日DNA克隆常用质粒载体→改进的pUC18第32页，共83页，星期日，2025年，2月5日琼脂培养基上的菌落原位印迹到滤膜上制备32P标记的DNA分子探针（如用PCR法）与膜上的核酸杂交放射自显影法确定转化子挑出阳性菌落培养或进入下一步操作DNA分子杂交直接鉴定-分子探针方法鉴定第33页，共83页，星期日，2025年，2月5日重组基因导入宿主菌（即转化或转染）将目的基因克隆或转化到大肠杆菌细胞中的操作步骤包括：●制备感受态细胞感受态细胞（competentcell）－受体细胞处理后所处的易接受外源基因的状态●用重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞；●筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞，进行检查或鉴定。第34页，共83页，星期日，2025年，2月5日基因克隆获得大量目的基因后，就要使其在合适的宿主细胞中表达，产生需要的基因表达产物或使宿主生物具备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳定遗传。这一过程就是遗传转化。若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对转化的大肠杆菌或转化的细胞（即转化子）进行培养，使目的基因大量表达和积累，然后对表达产物分离纯化，便可获得想要的产品。导入基因的大肠杆菌细胞是基因克隆的宿主，可大量表达目的基因。■转化或转染受体细胞及转化子的筛选第35页，共83页，星期日，2025年，2月5日植物和动物的遗传转化常用的方法载体法转化——如上所述的细菌的质粒转化等。植物采用的是农杆菌介导法（Ti质粒）基因的直接转移（1）高压电脉冲电激穿孔（2）基因枪法（3）微注射法（4）同源重组等等第36页，共83页，星期日，2025年，2月5日宿主菌或受体细胞：大肠杆菌蓝藻酵母昆虫细胞哺乳动物细胞植物原生质体细胞（除去细胞壁的）通过DNA体外重组技术构建的重组质粒除了转化到细菌中表达外，还可以直接用以转化蓝藻等原核生物或其他一些原生生物细胞以及酵母、昆虫、哺乳动物CHO等真核生物细胞。也可直接转染到动、植物细胞培养。第37页，共83页，星期日，2025年，2月5日举蓝藻例：构建缺失chlL基因的蓝细菌（即蓝藻）突变株（直接转化法之一）chlL－一种控制叶绿素合成的基因第38页，共83页，星期日，2025年，2月5日Southern分子杂交分析－示例（用探针杂交）A.DNA体外重组实验B.抗生素筛选转化子细胞C.培养突变株细胞D.Southern杂交实验结果显示，外源目的基因已经转入突变株细胞中第39页，共83页，星期日，2025年，2月5日对转化子的筛选和克隆基因的鉴定原理：琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段：DNA片段上的磷酸基团带负电荷酶解片段向阳极移动，受到电场驱动力和凝胶阻力两种作用-不同大小的DNA片段的迁移率不同（参照已知分子量标准的迁移率，找出未知片段）酶切和电泳方法-最常用的鉴定转化子即转基因生物的基因的方法第40页，共83页，星期日，2025年，2月5日纪念发明者EdwardSouthern（1）提取总DNA（2）酶解总DNA（3）对酶切产物电泳（4）转移到滤膜（5）变性解链（6）DNA探针杂交（7）洗脱（8）放射自显影（9）比较分析又称DNA杂交法转化子的分析－Southern杂交鉴定克隆第41页，共83页，星期日，20