华溪蟹HMGBa基因克隆和表达纯化及对镉暴露的应答研究.pdf

摘要

B1highmobilitygroupbox-1protein,HMGB1

高迁移率族蛋白（）作为一种

非组蛋白染色体结合蛋白，在进化过程中呈现出高度的保守性，在核内与DNA相互

作用发挥调控基因转录的作用。当细胞受到外界刺激、损伤或坏死的情况下，HMGB1

会分泌到细胞外环境作为一个损伤相关分子模式(Damage-associatedmolecular

patterns,DAMP)警示细胞处于危险状态，可作为促炎因子在无脊椎动物组织修复

和先天免疫防御系统中发挥重要作用。镉作为有毒重金属，随食物链在水体中大量

积累，并通过多种途径聚集在甲壳类动物肝胰腺、鳃和肌肉等组织中且无法代谢。

研究表明，镉会造成线粒体形态的改变进而引起氧化应激，导致减少能量的产生并

影响动物的新陈代谢，甚至造成组织损伤和细胞凋亡。也可直接与免疫细胞相互作

用，激活免疫细胞中多种信号传导途径。为了丰富HMGB1在无脊椎动物中的研究，

进一步探究HMGB作为DAMP分子在溪蟹先天免疫中的激活作用，以及在镉胁迫

下对免疫系统的预警和防御作用。基于本课题组前期获得的河南华溪蟹（Sinopotamon

henanenseHMGBaShHMGBa

）基因片段，完整克隆得到了溪蟹基因序列。本学位论

文就HMGB1对镉的应答、蛋白功能以及在先天免疫防御系统中的作用进行了进一

步研究，旨在发掘HMGB1在应对镉胁迫中发挥的功能。同时为重金属污染和

绿色养殖提供新的方向和靶标。研究内容包括三个方面：

1.河南华溪蟹ShHMGBa基因全长的克隆、生信分析和组织分布情况。首先，

通过RACEPCR技术，克隆得到溪蟹ShHMGBa基因序列全长；其次，分析了

ShHMGBa基因序列，构建了系统进化树；最后，利用实时荧光定量PCR技术对

ShHMGBa基因的组织分布情况进行了检测。

2.构建河南华溪蟹ShHMGBa原核表达系统，并进行蛋白诱导和纯化以及对融

合蛋白的功能检测。利用基因工程技术，构建了原核表达载体pET-28a(+)-ShHMGBa，

转入表达菌后成功诱导表达，并利用亲和层析技术纯化目的蛋白。之后，利用凝胶

阻滞实验和抑菌圈实验对融合蛋白进行功能检测。

3.分析镉暴露后河南华溪蟹ShHMGBa的表达模式，并构建rShHMGBa蛋白

ShDorsal14.5mg/L1/16

注射模型检测对核转录因子的影响。设计三个镉浓度组：（

LC）、29mg/L（1/8LC）、58mg/L（1/4LC）CdCl，和一个空白对照组（control），

5050502

1d3d5dRNAcDNA

在镉暴露、、，取鳃、肝胰腺和肠组织提取总并反转成，利用

实时荧光定量PCR技术对ShHMGBa基因表达量进行检测。利用免疫荧光技术，对

I

镉胁迫1d后的血细胞和肝胰腺组织中的ShHMGBa蛋白定位进行检测。同时，构建

了rShHMGBa蛋白注射模型，并观察了ShDorsal蛋白在血细胞中的定位。

研究结果如下：

1.河南华溪蟹ShHMGBa基因cDNA序列获取、序列信息和不同组织基因表达

ShHMGBa1016bp684bp5′69bp

量。溪蟹基因序列全长，开放阅读框，端非编码区