荧光免疫试验.ppt

2.stokes位移:激发光谱和发射光谱的波长差。stokes位移小，相互干扰，影响结果准确性。镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光谱和发射光谱不重叠时间分辨荧光免疫测定第31页，共53页，星期日，2025年，2月5日发射光谱带较窄：613nm±10nm，干扰少激发光谱带较宽：300nm～350nm，灵敏度高3.发射光谱和激发光谱时间分辨荧光免疫测定第32页，共53页，星期日，2025年，2月5日4.荧光标记物的相对比活性比活性：单位时间内每个标记分子可被探测到的信号量。Eu3+螯合物反复激发1000次/秒大大提高了荧光标记物比活性时间分辨荧光免疫测定第33页，共53页，星期日，2025年，2月5日结合β-二酮体Eu3+解离酸性增强液荧光增强Eu3+标记抗原抗体复合物5.信号增强时间分辨荧光免疫测定第34页，共53页，星期日，2025年，2月5日（二）标记物和标记方法时间分辨荧光免疫测定第35页，共53页，星期日，2025年，2月5日（三）方法类型双抗体夹心法固相抗体竞争法固相抗原竞争法时间分辨荧光免疫测定第36页，共53页，星期日，2025年，2月5日（三）方法类型时间分辨荧光免疫测定（双抗体夹心法）示意图第37页，共53页，星期日，2025年，2月5日灵敏度高：最小检出量10-18mol/L分析范围宽：4～5个数量级标记物稳定：有效使用期长测量快速，易自动化易受污染，本底增高方法评价时间分辨荧光免疫测定第38页，共53页，星期日，2025年，2月5日关于荧光免疫试验第1页，共53页，星期日，2025年，2月5日掌握：荧光的基本知识；荧光抗体染色与结果判断。熟悉：荧光物质。了解：荧光抗体的制备；荧光显微镜的基本结构；荧光免疫分析；荧光免疫技术的应用。教学目的第2页，共53页，星期日，2025年，2月5日第一节荧光免疫试验的组成因素第二节间接免疫荧光试验第三节流式荧光免疫试验第四节其他与荧光检测相关的免疫试验第五节荧光免疫试验的临床应用第六节影响荧光免疫试验的主要因素第3页，共53页，星期日，2025年，2月5日荧光免疫试验（fluoroimmunoassay):以荧光物质标记抗体和抗原，通过与相应抗原或抗体发生特异性结合反应，以此对待测物进行定位、定性和定量分析的检测技术，具有高度特异性、敏感性和直观性，是最早出现的免疫标记技术。第4页，共53页，星期日，2025年，2月5日荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。第一节荧光免疫试验的组成要素吸收能量激发态基态荧光效率第5页，共53页，星期日，2025年，2月5日荧光特点：1可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；2一旦停止供能，荧光随之瞬间消失；第6页，共53页，星期日，2025年，2月5日(一)荧光的基本知识1.发射光谱:指固定激发光波长，在不同波长下记录到的标本发射荧光的谱图。2.激发光谱:指固定检测发射光波长，用不同波长的激发光照射标品得到的荧光的谱图。一荧光及荧光物质基础知识第7页，共53页，星期日，2025年，2月5日荧光效率＝吸收光的光量子数（激发光强度）发射荧光的光量子数（荧光强度）荧光色素本身的物理特性激发光强度及激发光波长决定于决定于3.荧光物质将吸收的光能转变成荧光的百分率------荧光效率第8页，共53页，星期日，2025年，2月5日定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。各种荧光物质的荧光寿命不同。4.荧光寿命第9页，共53页，星期日，2025年，2月5日5.荧光淬灭:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、高温（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等。第10页，共53页，星期日，2025年，2月5日如何避免：勿长时间照射脉冲瞬间照射避光保存猝灭剂：具有荧光猝灭作用的物质荧光淬灭第11页，共53页，星期日，2025年，2月5日荧光物质最大吸收光谱最大发射光谱应用异硫氰酸荧光素(FITC)490～495nm520～530nm（黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT藻红蛋白（PE）490-560nm595nm（红色）双标记FAT、流式细胞术7