《动物实验技术》课件——任务1：动物组织石蜡切片的制备.pptxVIP

动物实验技术

病理学（Pathology）是研究疾病的病因、发病机制、病理变化结局与转归的医学科学；帮助人类了解疾病的发生发展规律,阐明疾病本质；同时病理学科也是基础医学与临床医学的桥梁。

由于生物样品各种组织成分不同，因此性质也各异，如软硬程度，疏松、致密程度，面积大小等都不相同，自然状态下要将它们切成十几微米甚至几个微米的薄片，几乎是办不到的。

包埋(embedding)就是将某些特殊的支持物质浸入到组织块内部，利用支持物质的物理特性，如由液态转变成固态，使整个组织具有均匀一致的固态结构和足够的硬度，以利于用切片机制取极薄的切片。

利用石蜡(paraffin)作为包埋剂，将浸过蜡的组织块置于石蜡内制成蜡块，是组织学切片技术中最常用的一种包埋方法。

石蜡切片能使组织结构保存良好，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值。

优点：组织结构保存良好，能切连续薄片。组织结构清晰，抗原定位准确。可长期保存。

缺点：制片过程中要经过酒精、二甲苯等有机溶剂处理，组织内抗原活性失去较多。

解决方式：抗原热修复---柠檬酸盐缓冲液高温煮30min(有效去除醛类固定剂导致的蛋白之间的交联，充分暴漏石蜡切片等，样品中的抗原表位，从而大大改善免疫染色效果)。

把固定后的组织或未经固定的新鲜组织，不经乙醇脱水、透明、浸蜡等一系列复杂的处理，直接液氮速冻变硬进行切片。

由于组织不经有机溶剂的处理，不受浸蜡、包埋时高温影响，所以能较好地保存各种酶、抗原的活性及脂肪、类脂的结构。

冰冻切片的制作过程简单，一般只需几十分钟便可制成；

在冰冻过程中，组织中水分易形成冰晶，往往影响抗原定位，同时冰冻切片比石蜡切片要厚，一般8-80μm，且清晰度较差；

切片过程中易碎易烂，不能用于回顾性研究，切片标本只能低温短期保存。

组织在固定液长时间浸泡后，会含大量的水分，为了制片和长时间保存，必须将水分置换成石蜡；

水和石蜡互不相容，但水溶于乙醇，而乙醇和石蜡都可以溶于二甲苯，所以利用乙醇和二甲苯作为媒介，最终将组织中的水分替换成石蜡；

组织突然进入高浓度乙醇会发生收缩和变形，不利后续包埋、切片、染色，因此要从低浓度乙醇到高浓度乙醇中依次进行。

透明：脱水过程中，水分被乙醇取代，乙醇被石蜡的媒浸液取代，如二甲苯；而二甲苯与玻璃的折光率非常接近，采用光学显微镜观察，感觉组织块变得透亮，因此称之为透明，同时二甲苯也称为透明剂。

用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用，此过程为浸蜡过程。

通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1～2小时，

再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，

浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。

包埋：是将某些特殊的支持物质浸入到组织块内部，利用支持物质的物理特性，将整个组织加以包埋，最后凝固成均匀一致的较硬固态结构，以便切片机制备极薄切片。

1.先将融化的蜡放入包埋框，设定包埋机参数；将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋；

2.取预热包埋框及金属板，搭成包埋模具；倾注少量熔蜡于包埋框中；从蜡杯中夹取组织块，切面向下置于框底；加熔蜡至包埋框上缘，注意标签；

3.于-20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。

1.准备包埋蜡：一般应用硬蜡（56~58℃或60~62℃）为好，所用的石蜡要求透明无杂质，新的石蜡要反复熔凝，并有一定的粘韧性；蜡的熔点应与组织的硬度相适应；包埋用过的石蜡可以反复使用；

2.包埋用蜡的温度应略高于浸蜡温度，保证组织块与周围石蜡完全融为一体；

3.石蜡的迅速冷却非常重要，否则包埋块中将会产生结晶。以后切片时引起碎裂。

1.将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上；

2.将切片刀固定在刀夹上，刀口向上；

3.摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口；

4.调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右；

5.调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为4-10μm；

6.一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40-50r/min为宜；

7.切成的蜡带到20-30cm长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上；

8.用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻上加水一滴，置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好；

9.切片工作结束后，应将切片刀取下，擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。

了解病理切片技术的重要性与广泛应用，对比掌握石蜡切片与冰冻切片的优势与应用范围；

掌握石蜡切片技术流程与各环节注意事项，能独立完成不同组织的石蜡切片制备任务；

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