荧光染料选择和数据分析.ppt

荧光染料多色分析第30页，共74页，星期日，2025年，2月5日荧光素的选择原则第31页，共74页，星期日，2025年，2月5日选择荧光素需要考虑抗原的密度高表达的抗原可选择几乎所有的荧光素低密度表达的抗原需要可提供较高S/N比值的荧光素如PE/APC第32页，共74页，星期日，2025年，2月5日选择荧光素需要考虑自发荧光每种细胞群都有不同水平的自发荧光所有的荧光通道均可观察到自发荧光，但自发荧光强度在波长较长时迅速降低。对自发荧光较强的细胞，选择发射波长长的荧光素（如APC）可得到较好的S/N比值。对自发荧光比较弱的细胞，发射波长长的荧光素对S/N提高没有明显的改善。可选用FITC。第33页，共74页，星期日，2025年，2月5日选择荧光素需考虑非特异结合许多荧光抗体可产生低水平的非特异结合，使阴性细胞群的荧光超出自发荧光。非特异结合由下列因素引起单克隆抗体的同型抗体：一些IgG同型抗体可能与一些细胞上的Fc受体结合所用的荧光素羰花青染料（如CY3、CY5、CY5.5、CY7）和Tex-Red直标的抗体及一些复合染料标记的抗体在标记某些亚群的细胞时有时会提高结合率。对CY5来说，是因为该染料与低亲和力FC受体的极低亲和力相互作用。这也是复合染料PE-CY5的特性。第34页，共74页，星期日，2025年，2月5日选择荧光素需考虑复合染料：小心信号衰退复合染料因为光、固定剂或温度升高会致信号衰退，使复合染料在上一级染料处发光。该种现象从一小部分亚群开始，导致APC或PE染色细胞群假阳性。减少样本暴露于光、高温或固定剂，可很大程度上避免这一问题。选择染料时要考虑：复合染料的信号衰退会不会降低APC或PE的灵敏度。如果是，就要选择另外的试剂搭配。如果样本需要固定，要选择稳定的固定剂，可有效阻止复合染料的信号衰退。BD：338036第35页，共74页，星期日，2025年，2月5日选择荧光素需考虑仪器配置的差异，多色分析不可能全选“最亮”的荧光素，但对于特定的一款仪器，可以根据荧光的强弱列出可选的染料亮度的判断：就是荧光染料的灵敏度，区分背景和弱阳性信号的能力影响背景的因素有检测器的电子噪音、细胞自发荧光、来自其他检测器的信号干扰，这些因素也增加了阴性荧光峰的宽度（标准差）第36页，共74页，星期日，2025年，2月5日灵敏度好的标准是染色指数：D／W，D指的是阳性峰与阴性峰的平均荧光强度的差；W是阴性峰的2SD。第37页，共74页，星期日，2025年，2月5日选择荧光素需考虑荧光信号之间的干扰，会增加信号检测背景荧光信号强细胞群体的SD比荧光信号弱的细胞群体大。多色分析时，一种荧光素（如FITC）的光会漏入相邻的荧光素（如PE）的检测器。漏入的光越多，需要补偿的越多，对分辨率的影响越大。尤其是弱表达的信号。第38页，共74页，星期日，2025年，2月5日选择荧光素需考虑多色荧光信号之间的干扰第39页，共74页，星期日，2025年，2月5日选择荧光素需考虑多色荧光信号之间的干扰IFN?APC+CD8APC-CY7+CD4PE+IL-2PE-CY7第40页，共74页，星期日，2025年，2月5日选择荧光素需考虑多色荧光信号之间的干扰IFN?APC+CD4PE+IL-2PE-CY7第41页，共74页，星期日，2025年，2月5日选择荧光素需考虑多色荧光信号之间的干扰第42页，共74页，星期日，2025年，2月5日选择荧光素需考虑多色荧光信号之间的干扰第43页，共74页，星期日，2025年，2月5日选择荧光素需考虑多色荧光信号之间的干扰第44页，共74页，星期日，2025年，2月5日选择荧光素需考虑尽量减少荧光信号之间的干扰检测的颜色越多，面临的荧光信号之间的干扰越多选择试剂组合时尽可能降低荧光发射波长之间的重叠第45页，共74页，星期日，2025年，2月5日组合荧光素选择常见的6、8、10色荧光染料组合第46页，共74页，星期日，2025年，2月5日设立对照，以证实试剂组合有效真实性对照（fidelitycontrol）：单一的荧光抗体染色与试剂组合染色结果比较，以确保试剂组合中的其它试剂不影响结果。减去一个荧光对照（Fluorescence-minus-onecontrol,FMO）：除去一个荧光抗体，将其他所有试剂组合在一起。第47页，共74页，星期日，2025年，2月5日荧光素选择原则上述原则可能相互冲突，但要取得平衡以得到最佳结果。原则1：选择适合仪器配置的最“亮”的荧光染料原则2：选择光谱重叠最少的荧光素原则3：为最“暗”